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Agilent ChemStation Agilent per sistemi LC 3D Conoscere il modulo di valutazione spettri Manual(1)

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1. 14 Conoscere il modulo di valutazione spettri Conoscere l analisis degli specttri 1 Stili di rapporti relativi a spettri Con il modulo di valutazione spettri sono disponibili i seguenti tipi di bollettini La funzione Library Search produce un rapporto calibrato che comprende i risultati della ricerca in biblioteca Il numero dei picchi i tempi di ritenzione i fattori di corrispondenza della ricerca in biblioteca le quantit ed i nomi dei composti vengono stampati secondo i parametri specificati nella finestra di dialogo Automated Library Search Per ulteriori informazioni consultare Descrizione del rapporto a pagina 21 Short Spectrum comprende le condizioni dello strumento il cromatogramma risultati quantitativi e informazioni sulla purezza di picchi Detail Spectrum comprende titolo condizioni dello strumento il cromatogramma risultati di tipo quantitativo curve di calibrazione ed informazioni sulla purezza dei picchi l intestazione viene archiviata in un file chiamato RPTHEAD TXT nella directory relativa al metodo E possibile modificare l intestazione utilizzando un editore di testi ed inserire un testo specifico per quel metodo Performance Lib Search combina gli stili Performance e Library Search Informazioni sulla purezza dei picchi Le informazioni si riferiscono alla valutazione degli spettri all interno dei picchi che risultano dai diagrammi di purezza di ogni composto Questi
2. Draw Spectral Difference Off Draw amp Use Similarity Curve Off Include Treshold Curve Off Draw Signals On Extracted from Spectra Draw Signal Ratios Off Spectra per Peak Automatic 5 Purity Purity threshold 990 Informazioni aggiuntive Reference Spectra Possono anche essere usati spettri di riferimento manuali con purezza dei picchi interattiva Spectra per Peak Questi spettri vengono usati per calcoli sulla purezza dei picchi Si pu stabilire il numero di spettri per picco a 5 o a 7 Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza dei picchi Threshold mAU dipende dal sistema da 0 a 5 MAU Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza dei picchi Spettri con una scala di assorbanza inferiore a questo valore non vengono usati in calcoli sulla purezza Purity Usata per determinare picchi puri impuri Conoscere il modulo di valutazione spettri 61 3 62 Valutazione della purezza dei picchi Impostazione raccomandata per Advanced Purity Processo del segnale Scala temporale del segnale da visualizzare peak width 4 Absorbance threshold for signals mAU 2 Normalize Maximum Processamento degli spettri Non utilizzato Spectra Normalization Normalize Match Purity livello di purezza calcolato con Apex spectrum Curva di soglia Non utilizzata Informazioni aggiuntive Purity Si pu anche usare l impostazione per gli spettri Average o All Esempio n 4 Spettri acquisiti i
3. inizio e la fine del picco definito dall integratore Si possono definire le opzioni per tracciare le curve di similarit nella finestra di dialogo Advanced Purity Preferences Nnorm 67 1 5 2 4 3 4 21 3 4 1 0 7000 1 Diagrammi del segnale relativo al picco 2 Inizio del picco 3 Inizio dello spettro di riferimento 4 Curva di similarit 5 Posizione degli spettri selezionati 6 Fine del picco 7 Fine dello spettro di riferimento 8 Curva di soglia 9 Marcatura degli spettri Figura 9 Finestra dei segnali del picco contenente curve di similarit e di soglia Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Curve di threshold L influenza del rumore illustrata dalla Figura 10 Il fattore di similarit diminuisce con l aumento del rapporto segnale rumore o con un livello di rumore costante ed una scala di assorbanza decrescente Intervallo di assorbanza mAU 25 25 mAU 20 Impurezza spettrale al di sopra del livello di rumore 5 mAU 10 5 Impurezza spettrale 1 mAU entro il livello di rumore T T T T T T 1000 990 980 970 960 950 940 Similarit decrescente Figura 10 Fattore di similarit come funzione del livello del rumore Conoscere il modulo di valutazione spettri 45 3 Valutazione della purezza dei picchi La curva di soglia mostra gli effetti del rumore su di una curva di similarit data L effetto aumenta rapidamente avvicinand
4. sicuri che non ci sono picchi nella zona selezionata La Figura 13 a pagina 52 illustra i risultati per un picco puro Purity Evaluation of Peak 3 at 2 62 min C HPCHEM 1 DATA PUROLD PURE D I Signal DADI A Sig 210 10 Ref 380 60 Peaks 3 Date 9Sep91 8 30pm Peak Spectra Peak Si nals Exit E Show retention times Rapporto di similarit 190 5 nm Puriy O Spectra Differences Peak Signals Ratios Purity Ratio 0 386 100 of spectra Retention time 2 622 min Threshold 1 Calculated Width 0 070 min Reference Peak start and end spectra integrated 2 538 Platenumber 7731 Symmetry 0 841 Figura 13 Risultati per un picco puro Per un picco puro ogni punto del rapporto di similarit inferiore ad 1 gli spettri si sovrappongono bene e le differenze fra spettri non mostrano sistematicamente la stessa caratteristica La finestra verde e riporta The purity factor is within the calculated threshold limit Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 La Figura 14 a pagina 53 illustra i risultati per un picco con lo 0 5 di impurezza Purity Evaluation of Peak 3 at 2 62 min C HPCHEM 1 DATA PUROLD IMPOSPCT D Signal DADI A Sig 210 10 Ref 380 60 Peaks 3 Date 9Sep91 10 22 pm Show retention times Peak Spectra Peak Sign
5. Il raziogramma viene tracciato in una finestra dove l asse orizzontale il tempo e l asse verticale la lunghezza d onda Conoscere il modulo di valutazione spettri 33 3 Valutazione della purezza dei picchi I colori rappresentano i rapporti Valori elevati e valori bassi vengono identificati con colori diversi Questa procedura offre una visione d insieme rapida della purezza di tutti i picchi di un cromatogramma Puro Impuro mAU Rapporto lunghezza d onda Figura 6 Raziogramma Se un picco puro appare una serie di strisce parallele ed i colori di queste strisce saranno gli stessi per tutto il tempo di eluizione del picco Un picco puro ha un rapporto costante per tutta l ampiezza del picco Se un picco impuro il colore delle strisce cambia durante il tempo di eluizione Il rapporto non sar costante 34 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Purezza dei picchi Tecnica 3 Curve di similarit spettrale Le curve di similarit spettrale compaiono nella finestra Peak Signals dello schermo relativo alla purezza dei picchi Se i particolari visualizzati non sono chiari possibile avere una visione d insieme zoom tenendo premuto il tasto sinistro e muovendo contemporaneamente il mouse Ogni area viene disegnata sullo schermo appena il mouse viene spostato in quella zona Per tornare alla visualizzazione d origine fare due volte
6. Processamento degli spettri Non utilizzato Spectra Normalization Normalize Match Purity Livello di purezza calcolato con All peak spectra Curva di soglia Non utilizzata Informazioni aggiuntive Purity Si pu anche utilizzare l impostazione Average per gli spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri 63 3 Valutazione della purezza dei picchi Valutazione della purezza dei picchi A 05 0x Questa sezione descrive i metodi da utilizzare per valutare la purezza di un picco e Controllo della purezza dei picchi a pagina 25 e Visualizzazione della purezza dei picchi a pagina 70 e Utilizzo dell analisi di purezza dei picchi a pagina 48 e Purezza degli spettri di massa dei picchi a pagina 86 64 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Controllo della purezza del picco Una domanda importante per qualsiasi analisi cromatografica se il picco contiene uno o pi composti In un controllo di qualit le impurezze nascoste dietro il picco di interesse possono falsificare i risultati Nelle analisi finalizzate alla ricerca un componente nascosto o non rivelato pu portare ad una perdita di informazioni importanti per il lavoro di ricerca Che cos un controllo della purezza dei picchi AVVERTENZA Un controllo della purezza dei picchi stabilisce se un picco puro o se contiene impurezze Questa valutazione si basa su una comparazione fra spettri r
7. elevato che per gli spettri controllati da picco es fra 995 e 998 Conoscere il modulo di valutazione spettri 85 3 Valutazione della purezza dei picchi Purezza degli spettri di massa dei picchi 86 In LC MS le abbondanze di ioni che caratterizzano un composto raggiungono il massimo ad un particolare tempo di ritenzione quando la concentrazione di quel composto nel rivelatore a selezione di massa MSD al massimo A seconda delle condizioni cromatografiche e del tempo del ciclo di scansione i tempi di ritenzioni di picchi che eluiscono ad intervalli molto limitati possono risultare molto vicini fra loro e composti multipli possono apparire come un picco singolo o come un picco con distorsioni es spalle nel cromatogramma a ioni totali TIC Esaminando i tempi di ritenzione ai quali i singoli ioni raggiungono il massimo possibile raggruppare serie di ioni che raggiungono la concentrazione massima allo stesso tempo di ritenzione e presumere che questi ioni appartengono tutti allo stesso composto Se pi raggruppamenti di ioni raggiungono il massimo a diversi tempi di ritenzione compresi nello stesso picco cromatografico si pu dire che un picco impuro e possono essere determinati i singoli raggruppamenti di ioni In questo tipo di analisi si presume che e Icomposti di una miscela multicomponente possano essere separati sia dai propri spettri di massa sia dai rispettivi tempi di ritenzione Ogni componente della misce
8. All Spectra 1 Peril calcolo delle curve di purezza e di soglia vengono utilizzati tutti gli spettri di riferimento corretti registrati per quel picco al di sopra della Conoscere il modulo di valutazione spettri mn 3 78 Valutazione della purezza dei picchi soglia definita dall utente cinque di questi spettri compaiono nella finestra degli spettri I fattori di corrispondenza vengono calcolati fra ogni spettro e la media dei cinque spettri visualizzati nell apposita finestra quindi vengono rappresentati graficamente come punti singoli nella visualizzazione della purezza Per quanto riguarda la soglia stabilita dall utente la curva di similarit viene sovrapposta al diagramma di purezza Per la soglia calcolata il valore della soglia viene stabilito per ogni spettro i valori di purezza degli spettri sono definiti come il rapporto fra il valore di soglia e la curva di similarit dal quale risulta una linea retta Ci fornisce indicazioni pi precise sui punti di dati puri ed impuri Le curve di similarit e di soglia sono sovrapposte sul diagramma di purezza Spettri controllati da picco 1 Per il calcolo delle curve di purezza e di soglia vengono utilizzati tutti gli spettri di riferimento corretti registrati per quel picco al di sopra della soglia definita dall utente e riportati nella finestra degli spettri I fattori di corrispondenza vengono calcolati fra ogni spettro visualizzato nell apposita finestra e la media d
9. Curva di soglia Utilizzo di spettri specifici 71 73 76 Visualizzazione dei calcoli sulla purezza 77 Classificazione di picco come puro o impuro 78 Informazioni sulla purezza dei picchi 79 Advanced Peak Purity Options 81 Come utilizzare l analisi della purezza dei picchi 83 Acquisizione degli spettri 83 Impostazione delle opzioni relative alla purezza 84 Purezza degli spettri di massa dei picchi 86 Calcoli sulla purezza degli spettri di massa 87 Visualizzazione della purezza degli spettri di massa 88 Indice 89 Conoscere il modulo di valutazione spettri Sommario Sommario 8 Conoscere il modulo di valutazione spettri ChemStation Agilent per sistemi LC 3D Conoscere il modulo di valutazione spettri 1 Conoscere l analisis degli specttri Definizione dell analisi di spettri 10 Determinazione della lunghezza d onda ottimale 12 Stili di rapporti relativi a spettri 15 Hg Agilent Technologies 10 1 Conoscere l analisis degli specttri Definizione dell analisi di spettri L analisi degli spettri consente di processare i dati relativi a spettri acquisiti dal rivelatore a serie di diodi UV visibile o dal rivelatore a fluorescenza L analisi di dati spettrali aggiunge una terza dimensione ai dati analitici disponibili se viene utilizzata unitamente a dati cromatografici Asse di assorbanza Asse del tempo Asse della lunghezza d onda Cromatogramma Spettro Figura 1 Infor
10. al di sotto di 900 indicano che gli spettri sono diversi Match Factor Il fattore di corrispondenza dipende da un certo numero di parametri Questi parametri sono determinati dal campione e dal metodo di separazione Comprendono la specificit del composto l assorbimento spettrale della matrice del composto il livello di rumore e sia assorbimento di fondo sia spostamento di spettri causati da solvente o da strumenti diversi diversa calibrazione della lunghezza d onda Come rendere regolari gli spettri L affidabilit di un controllo della purezza limitata quando un rumore spettrale dello stesso ordine di grandezza dello spettro La regolarizzazione degli spettri funziona secondo le modalit che seguono Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 1 Per un numero definito di punti di dati ad esempio 5 definito anche filtro viene utilizzata una regressione cubica per determinare un nuovo punto di dati 2 Ilfiltro si sposta in avanti di un punto prendendo gli ultimi quattro dei dati gi usati ed il punto aggiuntivo quindi ripetendo Utilizzando l algoritmo di regolarizzazione il rumore statistico pu essere ridotto rendendo l identificazione dello spettro regolarizzato pi affidabile L algoritmo di regolarizzazione pu anche cambiare il profilo di uno spettro dipendentemente dalla lunghezza del filtro cio dal numero di punti di dati utilizzati nell algoritmo di r
11. dei picchi Curva di soglia La curva di soglia mostra l effetto del rumore su di una curva di similarit data L effetto aumenta rapidamente avvicinandosi l inizio e alla fine del picco In pratica una curva di soglia una curva di similarit di un picco puro con una componente di rumore di fondo L influenza del rumore pu essere osservata nella Figura 22 Il fattore di similarit diminuisce con il diminuire del rapporto segnale rumore o con un livello costante di rumore ed un intervallo di assorbanza decrescente Intervallo di assorbanza mAU 25 mAU 20 Impurezza spettrale al di sopra del livello di rumore 5 mAU 10 5 Impurezza spettrale 1 mAU entro il livello di rumore 1000 990 980 970 960 950 940 Similarit decrescente Figura 22 Fattore di similarit come funzione del livello del rumore 74 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 La Figura 23 a mostra una curva di similarit ed una di soglia per un picco puro in presenza di rumore Figura 23 b per un picco non puro a Picco senza impurezze ma con rumore b Picco con impurezze e rumore 5 di impurezza 980 980 Z Curva di soglia Curva di similarit Curva di similarit Curva di soglia 1000 1000 Rumore 0 1 mAU Spettro dell impurezza 1 mAU Figura 23 Finestra dei segnali del picco contenente curve di similarit e di soglia La soglia di rumore viene determinata autom
12. di K diverso causer una deviazione dal diagramma di rapporto piano Le deviazioni rispetto ad un diagramma completamente piano possono anche essere provocate da un fondo mutevole gradienti ripidi o rumore della linea di base Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 La Figura 5 illustra i segnali ed una rappresentazione grafica del rapporto di assorbanza sia per i picchi puri sia per i picchi impuri Bisognerebbe sempre stabilire una soglia per evitare rumori eccessivi sul raziogramma Quando entrambi i segnali sono al di sotto della soglia il rapporto stabilito a zero Assorbanza 2272 mAU dea Segnale A 100 Segnale B sa r mN PA amp Pa 2 8 e a 8 2 Be 8 8 Tempo min s Rapporto A B DE N Impuro Puro 1 4 e A cati 1 2 Sa 1 1 l l L _ TB rog Bia E g 2 B 4 B E Tempo min Figura 5 Rapporto segnale relativo a picchi puri e picchi impuri Raziogramma Un altra tecnica per controllare la purezza dei picchi utilizza il calcolo di rapporti di assorbanza multipli per generare un raziogramma Invece di poche lunghezze d onda selezionate i rapporti sono rappresentati a tutte le lunghezze d onda relative alla lunghezza d onda di massima assorbanza Il programma ricerca la lunghezza d onda di massima assorbanza per ogni spettro e traccia il rapporto di assorbanza ad altre lunghezze d onda per ogni spettro lungo l intero cromatogramma
13. gradienti Sono disponibili altre modalit di riferimento per ristabilire compatibilit con versioni precedenti di software od ottenere alcune nformazioni sulla purezza anche se sono stati raccolti solo alcuni spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Se due picchi non sono completamente separati alla linea di base la selezione automatica di spettri di riferimento utilizzando Automatic Reference Selection pu portare ad uno spettro di riferimento scelto nella valle fra i due picchi Un picco non risolto non pu essere puro In questo caso deve essere utilizzato un test di purezza per verificare l esistenza di componenti nascosti Usare la selezione manuale per scegliere gli spettri di riferimento prima e dopo il gruppo di picchi Soglia di purezza Se i dati sono stati raccolti acquisendo spettri controllati da picco necessario inserire un valore per la soglia di purezza Di solito il valore di default di 990 produce risultati accettabili Se i dati sono stati acquisiti utilizzando le funzioni All spectra o All in peak i migliori risultati si otterrano consentendo alla ChemStation di calcolare una soglia per ogni spettro basandosi sul rapporto segnale rumore relativo a quel picco In alternativa possibile fissare una soglia per tutte le scansioni del picco sebbene questa operazione non sia consigliabile Se si desidera utilizzare una soglia fissa utilizzare un valore molto pi
14. pi composti In un controllo di qualit le impurezze nascoste dietro il picco di interesse possono falsificare i risultati Nelle analisi finalizzate alla ricerca un componente nascosto o non rivelato pu portare ad una perdita di informazioni importanti per il lavoro di ricerca Che cos un controllo della purezza del picco AVVERTENZA Un controllo della purezza dei picchi stabilisce se un picco puro o se contiene impurezze Questa valutazione si basa su una comparazione fra spettri registrati durante l eluizione del picco Di solito si usano tre spettri per ogni picco per determinare la purezza Due spettri vengono presi ai punti di flesso lo spettro ascendente e quello discendente ed uno all apice spettro dell apice o superiore Se richiesto si possono selezionare 5 7 9 o tutti gli spettri per effettuare calcoli sulla purezza Se questi spettri di picco non sono identici in teoria il picco contiene impurezze L impurezza spettrale pu essere causata da uno o pi componenti picchi non separati alla linea di base o da assorbimento di fondo Il diagramma di purezza del picco comprende gli spettri del picco disegnati in modo normalizzato e sovrapposti Il fattore di purezza la misura della similarit della forma degli spettri L impurezza del picco pu essere rilevata anche in presenza di un assorbimento di fondo nel sistema che pu essere corretto Di solito l assorbimento di fondo non interferisce sulla qua
15. picchi Signal Peaks Purity Evaluation of Peak 4 at 2 41 min f C AHPCHEM 1 DATA PAR1 PAR10024 D DADI A Sig 254 4 Ref 550 100 15 Date 5 19 95 3 29 34 PM Aal n D Show retention times Peak Spectra Peak Signals Exit 189 0 nan nm 349 0 2 20 min 2 78 Puriy O S ectra O Differences Peak Signals O Ratios 10 51 100 of spectra Retention time 2 412 min 11 Calculated Width 0074 min Peak start and end spectra integrated 2 278 Platenumber 5860 Symmetry 0 723 Figura 17 Valutazione della purezza con assorbanza di fondo elevata Per risolvere questo problema basta ridurre l intervallo di lunghezze d onda per eliminare la zona problematica in questo caso impostando il limite inferiore a 220 nm e ripetere il test I risultati sono illustrati dalla Figura 18 Purity Evaluation of Peak 4 at 2 41 min C HPCHEM 1 DATA PAR1 PAR10024 D la Signal DADI A Sig 254 4 Rief 55C 1C0 Peaks 5 Date 5 19 95 3 29 34 PM E Show retention times Peak S ectra eak Signals 221 0 Purity Ratio Puriy Spectra nm 349 0 2 20 min O Differences 0 235 100 of spectra Peak Signals Retention time 2 412 min Ratios Threshold 11 Calculated Reference Peak start and end spectra integr
16. primo costituito da dati non lineari provocati da una concentrazione di campione troppo elevata Quest ultimo problema facile da individuare dato che lo spettro dell apice non corrisponde a nessun altro spettro del picco e si ottiene la caratteristica forma ad M come rapporto di similarit come illustrato dalla Figura 16 Purity Evaluation of Peak 1 at 6 26 min CAHPCHEMX1 DATA RAM 056 0101 D Signal DADI A Sig 290 4 Ref 450 4 Peaks 1 Date 2 6 95 7 55 07 PM C Show retention times Peak Spectra Peak Signals Exit Caratteristica forma ad M 211 0 nm 351 0 5 73 min 7 54 The purity factor exceeds the calculated threshold limit Puriy O Siectra O Differences Peak Signals O Ratios Purity Ratio 13 939 85 of spectra Fetentiontime 6263 min Threshold 11 Calculated Width 0 205 min Reference Peak start and end spectra integrated 6 000 Platenumber 5168 LI Symmetry 0 766 Figura 16 Valutazione della purezza con dati non lineari Il secondo problema si verifica quando vengono comprese nella valutazione della purezza anche zone con elevata assorbanza di fondo In questo caso il rapporto di similarit diventa molto rumoroso e la sovrapposizione di spettri piuttosto scarsa come illustra la Figura 17 a pagina 56 Conoscere il modulo di valutazione spettri 55 3 56 Valutazione della purezza dei
17. questi errori possono essere evitati poich gli spettri UV Vis possono essere usati per confermare l identit dei picchi Gli spettri standard vengono acquisiti da un campione di riferimento in condizioni cromatografiche ben definite ed archiviati in un database biblioteca di spettri Per ogni campione sconosciuto possibile paragonare gli spettri del picco con quelli archiviati in una o pi biblioteche Gli spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri 3 possono essere sovrapposti per una comparazione visiva e si possono calcolare le affinit fra gli spettri dei campioni e degli standard La ChemStation in grado di automatizzare questo processo per tutti i picchi compresi in un cromatogramma e per tutti i cromatogrammi di una sequenza Oltre a questo tipo di conferma il software pu eseguire un controllo della purezza utilizzando le impostazioni della finestra di dialogo Purity Preferences Questi risultati qualitativi possono essere combinati con risultati quantitativi nello stesso rapporto di stampa Quest ultimo contiene tutte le informazioni di cui l analista ha bisogno per ogni picco dell analisi come e Il nome del composto La quantit Il tempo di ritenzione Il fattore di corrispondenza dell identit Il fattore di corrispondenza della purezza Questo capitolo descrive i concetti che stanno alla base di una ricerca in biblioteca di spettri Per maggiori informazioni su come si effettua questo t
18. tutti spettro e tutti spettro e tutti spettri gli altri spettri gli altri spettri gli altri spettri Figura 8 Curve di rapporto per diversi spettri specificati dello stesso picco La Figura 8 illustra la curva di rapporto per lo spettro anteriore dell apice di coda e di media di un picco contentente un impurezza dopo il massimo della risposta apice Lo spettro del fronte anteriore da solo una piccola impurezza spettrale alla fine del picco La deviazione di questa prima curva di rapporto piccola perch lo spettro anteriore assorbe poco con una curva di soglia alta Lo spettro all apice evidenzia un livello di impurezza basso nella parte anteriore del picco lo spettro all apice contiene solo una quantit molto limitata di impurezze ed un livello molto alto in coda al picco Conoscere il modulo di valutazione spettri 37 3 38 Valutazione della purezza dei picchi Lo spettro di coda con un livello di impurezza molto elevato produce impurezza spettrale nella parte anteriore del picco Lo spettro medio la media degli spettri del picco in questo caso gli spettri sull inclinazione ascendente discendente e sull apice indica l impurezza spettrale sul totale del picco Questo spettro contiene il contributo spettrale dell impurezza In questo caso lo spettro medio contiene un contributo dell impurezza maggiore rispetto allo spettro all apice con una maggiore impurezza sul fronte dell eluizione o della migrazion
19. 25 65 curve di similarit fra spettri 73 rumore 45 utilizzo di spettri specifici 37 76 purezza di picchi spettrale di massa 86 purezza spettrale di massa 86 purezza spettrale di massa dei picchi 86 89 Indice rapporto diagramma del segnale 32 raziogramma 33 34 calcolo del rapporto di assorbanza 33 report di ricerca in biblioteca 15 purezza dei picchi 15 spettri 15 Ricerca automatica in biblioteca analisi dei composti per obbiettivi 19 purezza dei picchi 20 Ricerca automatica in biblioteca di spettri 18 introduzione 3 ricerca automatica in biblioteca di spettri sguardo d insieme 3 risultati errati 55 S segnale diagramma di rapporto 32 spectral analysis what is 10 spettri derivata 27 68 logaritmici 67 normalizzazione 29 71 regolari 26 67 spettri in derivata 27 68 spettri logaritmici 67 spettri regolari 26 67 spettri specifici 76 spettro correzione 31 68 riferimento 49 84 spettro all apice 37 77 spettro anteriore 37 76 spettro di coda 38 77 spettro di fluorescenza 13 spettro di media 77 spettro di riferimento 49 84 correzione di base 31 68 90 spettro medio 38 T target spectra 37 terza dimensione 10 V visualizzazione della purezza spettrale di massa 88 Conoscere il modulo di valutazione spettri www agilent com In questo volume Questo manuale descrive i concetti che stanno alla base del funzionamento del modulo di valutazione spett
20. ChemStation Agilent per sistemi LC 3D Conoscere il modulo di valutazione spettri SIAE Agilent Technologies Avvisi Agilent Technologies Inc 2003 Nessuna parte di questo manuale pu essere riprodotta in alcun formato o con alcun mezzo inclusa l archiviazione e la scansione elettroniche o la traduzione in una lingua straniera senza previo consenso scritto di Agilent Technologies Inc secondo le disposizioni di legge sul diritto d autore degli Stati Uniti internazionali e locali applicabili Codice del manuale G2180 94006 Edizione 06 03 Stampato in Germany Agilent Technologies Deutschland GmbH Hewlett Packard Strasse 8 76337 Waldbronn Germany Versione di software Questa Guida si applica alle revisioni A 10 xx del software ChemStation Agilent per sistemi LC 3D dove xx un numero compreso tra 00 e 99 e fa riferimento alle revisioni minori del software che non hanno effetto sull accuratezza tecnica della presente Guida Garanzia Le informazioni contenute in questo documento sono fornite allo stato corrente e sono soggette a modifiche senza preavviso nelle edizioni future Agilent non rilascia alcuna garanzia esplicita o implicita relativamente al presente manuale e alle informazioni in esso contenute Salvo il caso di dolo o colpa grave Agilent non sar responsabile di errori o danni diretti o indiretti relativi alla fornitura o all uso di questo documento o delle informazioni in esso contenu
21. N 20000 400 2 _ Figura 19 Controllo della purezza dei picchi mediante sovrapposizione di spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri 71 3 Valutazione della purezza dei picchi Visualizzazione della purezza dei picchi Finestra della purezza Il contenuto di questa finestra dipende dai parametri di purezza scelti Per default viene visualizzato il rapporto di purezza che riporta i segnali con le curve di soglia e di similarit sovrapposte vedere la Figura 20 Le bande verde e rossa nella parte inferiore rappresentano la soglia di purezza definita dall utente Il valore di purezza calcolato per ogni spettro rappresentato da un punto nero se il punto si trova all interno della banda verde allora la purezza dello spettro rientra nei limiti di accettabilit impostati Similarity value of PEENE each recorded Similarity Curve Threshold Selected spectrum curve peak spectra Purity of Peak 8 at 5 607 min peak start Si peak end reference spectrum exceeds threshold reference spectrum within threshold not used for calculation used for purity calculation Blue within threshold Red exceeds threshold Figura 20 Finestra della purezza 72 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Curve di similarit fra spettri Le curve di similarit fra spettri sono illustrate nellafinestra Purity durante la visualizzazione degli spettri veder
22. ONE 26 66 comparazione spettri 29 71 consigli 48 83 contorno linee 12 mappa 12 Contrassegno di corrispondenza in biblioteca 22 Contrassegno di nome del composto 22 controllo del segnale 51 Correzione del disturbo di fondo 31 68 curva di similarit 45 50 curva di soglia 42 45 73 74 78 81 display 46 75 curva di threshold 52 curve di similarit fra spettri 73 curve di similarit spettrale 35 cuva di similarit calcolo del livello di purezza 40 D determiniazione lunghezza d onda ottimale 12 diagramma di isoassorbanza 12 F fattore di corrispondenza 26 66 finestra dei segnali relativi al picco 73 finestra Peak Signals 35 fluorescenza spettro 13 fondo assorbimenti 25 65 identificare 18 impurezza 25 65 intervallo lineare 48 83 L inea di base correzione 31 68 ivello di purezza 51 unghezza d onda ottimizzazione 12 unghezza d onda ottimale 12 M multiplo rapporto di assorbanza 34 Conoscere il modulo di valutazione spettri normalizzazione spettri 29 71 0 operazioni su spettri comparazione 29 normalizzazione 29 operazioni sugli spettri comparazione 71 normalizzazione 71 P peak purity threshold curve 74 picchi impuri 54 picco impurezza 25 65 purezza 25 65 purezza 21 picco 25 65 purezza dei picchi curva di soglia 42 45 81 curve di similarit spettrale 35 spettrale di massa 86 purezza del picco cos
23. Purity Level Calculated With definisce quali spettri saranno utilizzati per la comparazione con ogni singolo spettro del picco Per gli spettri molto piccoli sarebbe utile utilizzare uno spettro medio Lo spettro all apice quello pi grande all interno del picco e l utilizzo di quest ultimo semplifica l interpretazione dei risultati Scegliendo la visualizzazione come Similarit Threshold viene effettuata una comparazione fra i risultati di ogni spettro ed i risultati previsti basandosi sul calcolo della soglia Se il rapporto risulta inferiore ad 1 il test per quello spettro stato superato se superiore ad 1 non stato superato Questa operazione elimina le misurazioni in scala che si producono spostandosi da spettri grandi a spettri piccoli Conoscere il modulo di valutazione spettri 51 3 52 Valutazione della purezza dei picchi Threshold Curve Per calcolare questa soglia il software utilizza gli spettri della linea di base per calcolare il rumore Di solito si utilizzano i primi quattordici spettri dell analisi Dato che questo tratto di linea di base precede il volume morto della colonna non deve essere presente nessun picco nella zona Se il picco lontano dall inizio dell analisi e si sta usando un gradiente pu essere pi accurato utilizzare gli spettri della linea di base pi vicini al picco possibile effettuare questa operazione regolando il tempo di inizio secondo valori diversi dove si
24. a uno spettro nella parte anteriore del picco ed uno spettro di coda ad ogni spettro e produce cos due rapporti di similarit La Figura 15 illustra i risultati utilizzando le impostazioni modificate Purity Evaluation of Peak 3 at 2 62 min f C HPCHEM 1 DATA PUROLDYUMPOS5PCT D Peaks 3 Date 9Sep 91 10 22 pm A Signal DAD1 A Sig 210 10 Ref 380 60 I Show retention times Peak Spectra Peak Signals Exit a 190 5 nm 412 5 2 31 min 3 07 The purity factor exceeds the calculated threshold limit Puriy O Spectra O Differences Pek Signals O Ratios Purity Ratio 1 766 39 of spectra Retention time 2 616 min Threshold 1 Calculated Widh 0 070 min Reference Peak start and end spectra integrated 2 525 Platenumber 7647 Symmetry 0 814 Figura 15 Picco con lo 0 5 di impurezza e diverse impostazioni di purezza Purity Set tings Questo consente di osservare la posizione approssimativa del componente principale e dell impurezza Si prega di osservare che le dimensioni relative dei rapporti di similarit non riflettono le dimensioni relative del componente principale e dell impurezza Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Risultati errati Due tipi di problemi molto comuni possono interferire sui risultati del test Il
25. ale Questi parametri permettono di ottenere risultati il pi possibile accurati ma richiedono molto spazio sul disco e molto tempo di calcolo L interpretazione manuale viene usata soprattutto per lo sviluppo dei metodi Impostazione raccomandata per Purity Preferences Spettro di riferimento Automatic Peak Baseline Wavelenght Range Come richiesto Purity Display Draw Spectra On Draw Spectral Difference On Draw amp Use Similarity Curve On Include Treshold Curve On Draw Signals On Extracted from Spectra Draw Signal Ratios Off Spectra per Peak Automatico 7 Informazioni aggiuntive Reference Spectra Possono anche essere usati spettri di riferimento manuali con purezza dei picchi interattiva Purity Display La curva di similarit viene usata per calcolare la purezza La curva di soglia si usa per il contributo del rumore Spectra per Peak Questi spettri vengono usati per costruire curve di similarit insieme a tutti gli spettri registrati nel picco Il numero di spettri dipende dall impostazione di Advanced Impostazione della purezza Per lo spettro medio usare 7o 9 per lo spettro anteriore o di coda usare 3 o 5 per gli spettri relativi a tutti i picchi usare 3 o 5 Soglia mAU dipende dal sistema da0 a 5 mAU Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza dei picchi Spettri con una scala di assorbanza inferiore a questo valore non vengono usati in calcoli sulla purezza Conoscere il modulo di
26. als Exit GR ci Rapporto di similarit 190 5 nm 4125 231 min 307 The purity factor exceeds the calculated threshold limit Puriy O Siectra Differences Peik O Signals O Ratios Purity Ratio 1 783 33 of spectra Retention time 2616 min Threshold 1 Calculated Widh 0070 mn Reference Peak start and end spectra integrated 2 52 Platenumber 7647 Symmetry 0 814 Li Figura 14 Risultati di un picco con lo 0 5 di impurezza Con lo 0 5 di impurezza il rapporto di similarit durante la visualizzazione dei segnali del picco sale al di sopra 1 Se il rapporto risulta al di sopra di 1 per tre o pi punti consecutivi il test sulla purezza risulta negativo la finestra si colora di rosso e segnala The purity factor exceeds the calculated threshold limit Le modifiche dello spettro e degli spettri di differenza mostrano caratteristiche definite Conoscere il modulo di valutazione spettri 53 3 54 Valutazione della purezza dei picchi Come caratterizzare meglio i picchi impuri Per caratterizzare meglio i picchi impuri si possono effettuare due semplici modifiche ai parametri di purezza e reimpostare il picco Nello schermo Purity Options modificare il numero di spettri per picco a 3 Nella finestra Advanced Purity Options impostare Purity level calcolato con Front and Tail Il software paragon
27. assimo quattro biblioteche specificate Per accelerare il processo o per aumentare l affidabilit possibile restringere la ricerca a spettri che rientrino nella stessa finestra di tempo di ritenzione utilizzando la funzione Library Search Template vedere la Figure 3 Finestra sinistra Tempo di ritenzione previsto Finestra destra Tempo min Figura 3 Finestra dei tempi di ritenzione Al picco viene attribuito il nome del composto che si avvicina di pi a quello che ci si aspetta possibile indicare quanto precisa deve essere la corrispondenza con un determinato valore di soglia Se si riesce a trovare una corrispondenza migliore di quella che costituisce la soglia il bollettino segnala che il picco stato identificato La ChemStation far quindi Conoscere il modulo di valutazione spettri Biblioteche di spettri 2 riferimento alla tavola di calibrazione per trovare un composto con lo stesso nome Se lo trova i dati vengono utilizzati per calcolare la quantit e riportarla Se non si trova un nome adatto sulla tavola di calibrazione viene indicata l identit del picco ma non viene calcolata la quantit dato che il metodo non calibrato per il composto Questa modalit consigliata per ricercare composti sconosciuti all interno di un analisi molto efficace quando il numero dei composti del cromatogramma basso rispetto al numero di componenti contenuti nella biblioteca 2 L analisi del composto obbiet
28. ated 2 278 Width 0 074 min Platenumber 5860 Symmetry 0 723 Figura 18 Valutazione della purezza con intervallo di lunghezze d onda ridotto Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Impostazioni consigliate Questa sezione contiene esempi per le finestre di dialogo Purity Options e Advanced Purity Options basandosi sulla modalit di raccolta degli spettri Esempio n 1 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco con curve di similarit Modalit automatica Questi parametri permettono di ottenere risultati il pi possibile accurati ma richiedono molto spazio sul disco e molto tempo di calcolo Impostazione raccomandata per Purity Preferences Spettro di riferimento Automatic Peak Baseline Wavelenght Range Come richiesto Purity Display Draw Spectra On Draw Spectral Difference On Draw amp Use Similarity Curve On Include Treshold Curve On Draw Signals On Extracted from Spectra Draw Signal Ratios Off Spectra per Peak Automatico 7 Informazioni aggiuntive Purity Display La curva di similarit viene usata per calcolare la purezza La curva di soglia si usa per il contributo del rumore Spectra per Peak Queste spettri vengono usati per costruire le curve di similarit come funzione con tutti gli spettri presenti nel picco Vedere Calcoli sulla purezza a pagina 39 per informazioni sulla soglia da utilizzare per gli spettri d
29. aticamente basandosi sulla deviazione standard di spettri puri con rumore ad un momento specificato per default 14 spettri all inizio dell analisi cio a 0 minuti La curva di soglia rappresentata da linee spezzate stabilisce i limiti entro i quali l impurezza spettrale rientra nei parametri di rumore stabiliti Al di sopra di questa soglia l impurezza spettrale supera il rumore di fondo e la curva di similarit si interseca con la curva di soglia indicando un impurezza ammesso che i parametri di riferimento e di rumore siano stati scelti con cognizione Conoscere il modulo di valutazione spettri 75 3 76 Valutazione della purezza dei picchi Utilizzo di spettri specifici La ChemStation consente di calcolare il fattore di purezza e le curve di similarit relativi a spettri diversi presi come obiettivo come illustrato dalla Come regola generale la comparazione di default con lo spettro medio fornisce le informazioni pi attendibili per la maggior parte delle impurezze non note La flessibilit di poter scegliere uno spettro specifico come obiettivo estremamente utile nei casi in cui l analista deve supporre dove si trova l impurezza o ha bisogno di migliorare la sensibilit durante la valutazione della purezza Un esempio pu aiutare a capire come sia possibile applicare questo principio se si presuppone che l impurezza si trovi in coda al picco selezionando lo spettro di coda o dell apice e paragonandolo a
30. basso per escludere per esempio lunghezze d onda dove l assorbanza della fase mobile causa un eccesso di rumore Un limite elevato pu invece essere impostato per escludere lunghezze d onda superiori alle quali il composto che interessa non assorba Processamento degli spettri Utilizzare questa funzione per effettuare calcoli matematici per trasformare regolarizzare o curvare spettri In pratica qualunque cosa aumenti le piccole differenze di spettri derivate aumenta anche il rumore mentre qualunque cosa riduca il rumore regolarizzazione diminuisce la sensibilit alle piccole modifiche spettrali Absorbance Threshold Imposta l intensit inferiore dello spettro che pu essere inserita nell analisi Di solito la soglia impostata ad 1 2 mAU per assicurare che gli spettri ai bordi del picco vengano compresi nel controllo della purezza Spettro di riferimento Gli spettri di riferimento sono spettri della linea di base utilizzati per correggere l assorbanza di fondo Consigliamo di usare sempre uno spettro di riferimento L impostazione consigliata Automatic In questo modo uno spettro viene preso dalla linea di base vicino all inizio ed alla fine dell integrazione L estrapolazione lineare di questi due spettri viene utilizzata per correggere tutti gli spettri del picco Dato che si tratta di un riferimento a due punti si pu compensare deviazioni del rivelatore e modifiche della composizione della fase mobile utilizzando
31. campione costante all interno della cella per tutta la durata dell analisi Processamento degli spettri I dati relativi agli spettri possono essere processati in diversi modi Per esempio possibile e Estrarre i segnali cromatografici da dati spettrali per determinare la lunghezza d onda ottimale di rivelazione per ogni picco e Effettuare una ricerca in biblioteca per un identificazione qualitativa Calcolare rapporti fra segnali per determinare la purezza dei picchi e Controllare la purezza dei picchi per individuare impurezze nascoste Conoscere il modulo di valutazione spettri 11 1 Conoscere l analisis degli specttri Determinazione della lunghezza d onda ottimale Durante lo sviluppo di un metodo dopo che sono state stabilite le condizioni adatte alla separazione dei picchi il passo successivo consiste nel trovare la lunghezza d onda ottimale di rivelazione per ogni picco Una tecnica consiste nella presentazione dell intensit del picco assorbanza o luminescenza della lunghezza d onda e del tempo sotto forma di carta delle linee di livello detta anche diagramma di isoassorbanza Questa tecnica rappresenta graficamente le informazioni sugli spettri sotto forma di una serie di linee concentriche di isoassorbanza sul diagramma relativo a lunghezza d onda e tempo Ci consente di presentare tutte le informazioni sugli spettri in modo che possano essere controllate contemporaneamente Vedere la parte centrale del
32. click sul tasto sinistro del mouse Le curve di similarit forniscono i dettagli sulla purezza dei picchi Tutti gli spettri di un picco vengono paragonati ad uno o pi spettri selezionati dall operatore Il grado di corrispondenza o similarit spettrale viene rappresentato in tempo reale durante l eluizione Un profilo ideale di picco puro una linea retta a 1000 come illustrato nella Figura 7 a All inizio ed alla fine di ogni picco dove diminuisce il rapporto segnale rumore il contributo del rumore di fondo spettrale agli spettri del picco diventa significativo Il contributo del rumore alla curva di similarit illustrato dalla Figura 7 b a Picco senza impurezza ne rumore b Picco senza impurezza ma con rumore 980 980 Curva di similarit Curva di similarit ei 1000 1000 Spettro del picco 20 mAU Rumore 0 1 mAU Figura 7 Curve di similarit per un picco puro con e senza rumore rappresentato in relazione al fattore di similarit ideale 1000 ed alla soglia definita dall utente 980 Conoscere il modulo di valutazione spettri 35 3 Valutazione della purezza dei picchi La seconda linea orizzontale che compare sul display la soglia di purezza stabilita dall utente impostata a 980 nella Figura 7 a pagina 35 Quando una curva giace al di sopra di questa linea mostra quale parte del picco fuori dalla definizione di purezza accettabile Curva di similarit visualizzata come soglia s
33. di corrispondenza adiacenti al di sotto del valore di soglia calcolato X vengono utilizzati per calcolare il livello di purezza Questi sei fattori di corrispondenza vengono utilizzati anche per calcolare il valore di soglia riportato nella finestra Purity Information Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Classificazione di picco come puro o impuro Il livello di purezza calcolato viene utilizzato per generare una definizione della purezza visualizzata sullo schermo Peak Spectra Se il fattore di purezza rientra nella soglia stabilito manualmente o calcolato dalla curva di soglia il picco viene classificato come puro Se il fattore di purezza supera il valore della soglia il picco viene classificato come impuro L impurezza rivelata un impurezza spettrale che non comporta necessariamente impurezza del composto Le impurezze degli spettri possono essere causate da modifiche della composizione del solvente gradienti o verificarsi in picchi non separati alla linea di base Conoscere il modulo di valutazione spettri 43 3 44 Valutazione della purezza dei picchi Layout of the Peak Signals Window La Figura 9 illustra un picco puro I contrassegni verso il basso indicano dove sono stati scelti gli spettri di riferimento I contrassegni al di sotto della linea di base mostrano dove sono stati scelti gli spettri ed usati per il calcolo ed i segni pi lunghi verso l alto mostrano l
34. diagrammi comprendono spettri sovrapposti e spettri normali oltre a segnali singoli e sovrapposti I diagrammi di purezza possono anche comprendere curve di threshold e di similarit a seconda delle impostazioni in Purity Preferences per quel particolare metodo Conoscere il modulo di valutazione spettri 15 1 Conoscere l analisis degli specttri I calcoli numerici comprendono il fattore di purezza una misura della similarit nella forma degli spettri Per ulteriori informazioni sulla purezza dei picchi consultare Chapter 3 Valutazione della purezza dei picchi A 04 0x e precedenti 16 Conoscere il modulo di valutazione spettri ChemStation Agilent per sistemi LC 3D Systems Conoscere il modulo di valutazione spettri 2 Biblioteche di spettri Metodi di ricerca 18 Descrizione del rapporto 21 Fg Agilent Technologies 2 Biblioteche di spettri Metodi di ricerca 18 Si pu usare uno dei tre metodi che seguono Sono necessari una biblioteca spettrale ed una tavola di calibrazione per tutti i metodi citati Come opzione possibile effettuare un controllo della purezza 1 Come identificare tramite ricerca in biblioteca spettrale Si tratta della modalit di ricerca pi comunemente usata La ChemStation utilizza il cromatogramma come base di partenza per la ricerca in biblioteca Il sistema confronta gli spettri dei picchi trovati dall integratore e caratterizzati da un tempo di ritenzione con spettri di al m
35. do non interferisce sulla quantificazione del picco dato che normalmente influenza anche l altezza dell inizio e della fine del picco tale difetto pu essere eliminato correggendo la linea di base Gli assorbimenti di fondo si possono modificare utlizzando solventi diversi o cambiando la composizione del solvente durante un analisi Il fattore di corrispondenza La rivelazione delle impurezze dei picchi per comparazione visiva di spettri richiede molto tempo e non adatta ad operazioni automatizzate Sono disponibili numerose tecniche statistiche per la comparazione automatica di spettri Una di queste la comparazione matematica fra due spettri Si tratta del calcolo di un fattore di corrispondenza che rappresenta il grado di similarit fra spettri La comparazione fra spettri d un fattore di corrispondenza definito come 10 x z ey i I valori x e y sono le assorbanze misurate rispettivamente nel primo e nel secondo spettro alla stessa lunghezza d onda n il numero di punti di dati ed X la somma dei dati Come limiti estremi un fattore di corrispondenza di 0 indica la mancanza di corrispondenza ed uno di 1000 indica spettri identici Generalmente un valore al di sopra di 990 indica che gli spettri sono simili Valori compresi fra 900 e 990 indicano l esistenza di una qualche similarit ma i risultati devono essere interpretati con cautela Tutti i valori al di sotto di 900 indicano che gli spettri sono diversi Match Facto
36. e per la correzione del fondo prima di determinare i raggruppamenti Ogni valore m z del gruppo viene esaminato in ogni scansione dell intervallo di tempo e l abbondanza massima archiviata con le abbondanze di entrambi le parti del massimo Viene archiviato solo un massimo per ogni valore m z Ogni massimo archiviato viene verificato controllando che non si presenti durante la prima o l ultima scansione e che non abbia un abbondanza zero da nessuno dei due lati Dopo aver calcolato un numero di scansioni interpolato per il valore m z e dopo aver effettuato una correzione del fondo viene prodotta una tavola contenente valori m z abbondanza e numeri di scansione interpolati in ordine di numero di scansione Conoscere il modulo di valutazione spettri 87 3 Valutazione della purezza dei picchi I raggruppamenti vengono determinati esaminando le abbondanze maggiori della lista in ordine crescente di numero di scansione Una volta registrato un raggruppamento viene calcolato il numero di scansione medio interpolato dei valori m z presenti nel raggruppamento stesso se il prossimo punto da considerare dista pi di met scansione dalla media si inizia un raggruppamento nuovo Il numero di raggruppamenti trovati viene riportato come numero di componenti il numero di scansione medio interpolato il numero di scansione che viene registrato ed i valori m z con le due abbondanze maggiori del raggruppamento sono registrati come ioni Un picc
37. e ed un impurezza minore alla coda rispetto alla curva di rapporto dello spettro all apice Il profilo delle curve di similarit di soglia e di rapporto dipende dalla posizione dal livello e dalle differenze spettrali dell impurezza quindi non possibile formulare un affermazione troppo generale Bisogna aspettarsi profili diversi a seconda della situazione Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Calcoli sulla purezza La scelta tra le opzioni che seguono determina il calcolo del livello di purezza e Draw and Use Similarity Curve e Include Threshold Curve e Purity Level Calculated With Il fattore di purezza non una misura assoluta della purezza del picco una funzione dei parametri utilizzati per i calcoli specialmente per la soglia di purezza Quindi i risultati devono essere interpretati a seconda della soglia stabilita Per i picchi puri si producono comunque risultati simili con impostazioni diverse Per i picchi impuri invece necessaria un analisi diversa Per il calcolo vengono considerati solo punti di dati che si riferiscono ad un impurezza ad esempio tutti gli spettri che giacciono al di sotto della soglia Quindi una modifica del valore della soglia pu influenzare in modo drastico il fattore di purezza per un picco impuro Per ulteriori dettagli sui calcoli consultare i parametri che seguono Per una descrizione dettagliata delle curve di similarit della ChemS
38. e la Figura 20 Se i particolari visualizzati non sono chiari possibile avere una visione d insieme zoom tenendo premuto il tasto sinistro e muovendo contemporaneamente il mouse Ogni area viene disegnata sullo schermo appena il mouse viene spostato in quella zona Per tornare alla visualizzazione d origine fare due volte click sul tasto sinistro del mouse Le curve di similarit forniscono i dettagli sulla purezza dei picchi Tutti gli spettri del picco vengono comparati ad uno o pi spettri per default uno spettro medio Il grado di corrispondenza o similarit spettrale viene rappresentato in tempo reale durante l eluizione Il profilo ideale per un picco puro una linea retta a 1000 come illustrato nella Figura 21 a All inizio ed alla fine di ogni picco dove diminuisce il rapporto segnale rumore il contributo del rumore di fondo spettrale agli spettri del picco diventa significativo Il contributo del rumore alla curva di similarit illustrato alla Figura 21 b a Picco senza impurezza ne rumore b Picco senza impurezza ma con rumore 980 980 Curva di similarit F Curva di similarit 1000 1000 Spettro del picco 20 mAU Rumore 0 1 mAU Figura 21 Curve di similarit per un picco puro con e senza rumore rappresentato in relazione al fattore di similarit ideale 1000 ed alla soglia definita dall utente 980 Conoscere il modulo di valutazione spettri 73 3 Valutazione della purezza
39. egistrati durante l eluizione del picco Di solito si usano cinque spettri per ogni picco per determinare la purezza due spettri per ognuna delle pendenze verso l alto e verso il basso ed uno sull apice spettro superiore o dell apice Viene calcolata la media dei cinque spettri e paragonata a tutti gli spettri registrati nel picco Se gli spettri del picco non sono identici allo spettro medio teoricamente quest ultimo contiene un impurezza spettrale L impurezza spettrale pu essere causata da uno o pi componenti picchi non separati alla linea di base o da assorbimento di fondo Se gli spettri sono identici il picco pu comunque contenere impurezze Ci pu essere vero se l assorbimento spettrale basso rispetto al composto principale o se l impurezza ed il composto principale hanno gli stessi spettri o spettri molto simili con tempi di eluizione simili La finestra di spettri contiene gli spettri del picco che comprendono gli spettri della comparazione media presi in modalit di normalizzazione o di sovrapposizione La finestra Purity contiene i segnali con sovrapposte informazioni sulla purezza Il fattore di purezza la misura della similarit della forma degli spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri 65 3 Valutazione della purezza dei picchi L impurezza del picco pu essere rilevata anche in presenza di un assorbimento di fondo nel sistema che pu essere corretto Di solito l assorbimento di fon
40. egolarizzazione in una sola volta Si consiglia di regolarizzare tutti gli spettri con lo stesso filtro prima di effettuare comparazioni Curvatura di spettri Se gli spettri sono stati acquisiti con una risoluzione bassa si pu usare la curvatura perch lo spettro sia pi simile ad una linea curva che ad un poligono Questa operazione viene effettuata calcolando ulteriori punti di dati fra i dati originali dello spettro utilizzando funzioni trigonometriche Quando gli spettri vengono curvati i punti di dati originali vengono conservati Spettri in derivata Le derivate di spettri rivelano particolari pi specifici rispetto agli spettri originali quando si paragonano composti diversi Piccole differenze fra spettri sono molto pi evidenti e facili da identificare visivamente Il rumore viene tuttavia aumentato e limita quindi l uso delle derivate spettrali Tecniche di purezza dei picchi Le tecniche di purezza del picco possono essere utilizzate solo con picchi che hanno una separazione alla linea di base Se i picchi non sono separati alla linea di base allora la determinazione della purezza dei picchi diventa pi complessa dato che ogni picco contiene quello vicino che appare come impurezza La purezza pu essere determinata in modo interattivo picco per picco per tutti i picchi di un file di dati o automaticamente alla fine di ogni analisi Conoscere il modulo di valutazione spettri 27 3 28 Valutazione della pure
41. el fattore di purezza e la base per il calcolo Threshold Per una soglia calcolata questo il valore di media di tutti gli spettri usati nel calcolo del fattore di purezza Per una soglia definita dall utente si tratta del valore impostato in Purity Options Peak Spectra Peak Spectra illustra i particolari dei cinque spettri scelti per i calcoli sulla purezza Si possono inoltre visualizzare e Difference spectra spettri calcolati come la differenza fra lo spettro di cui si calcolata la media e gli spettri singoli selezionati I picchi puri mostrano solo la presenza di rumore negli spettri differenza e Compared spectrum lo spettro medio per il calcoli di purezza e All recorded spectra tutti gli spettri registrati lungo il picco Reference spectra lo spettro o gli spettri utilizzati per i calcoli sulla purezza Conoscere il modulo di valutazione spettri 79 3 Valutazione della purezza dei picchi Calcolo della purezza e del rumore Le informazioni riportate nella finestra Purity Calculation illustrano il numero di spettri registrati e il numero di quelli che rientrano nella soglia o che superano la soglia utilizzati per calcolare il fattore di purezza Le informazioni contenute in Noise Calculation illustrano gli spettri utilizzati per calcolare la soglia di rumore ed i risultati del calcolo possibile visualizzare gli spettri del rumore unitamente ad un grafico di statistiche sul rumore Si possono anche mod
42. ezza Per i composti impuri gli spettri sull inclinazione ascendente e su quella discendente del picco sono in genere diversi e quindi entrambi usati per la ricerca u Composto impuro e spettro su inclinazione ascendente usato per l identificazione del picco d Composto impuro e spettro sull inclinazione discendente usato per l identificazione del picco Conoscere il modulo di valutazione spettri 21 22 Biblioteche di spettri Contrassegno di corrispondenza in biblioteca x Fattore di corrispondenza inferiore alla soglia Contrassegno di nome del composto 7 Composto identificato con un fattore di corrispondenza inferiore alla soglia stabilita Composto identificato con un nome gi attribuito ad un altro con un miglior fattore di corrispondenza Per questo non possibile trovare una corrispondenza migliore con un nome unico Contrassegni di quantit Quantit individuale alta il limite di quantit in Compound Details stato superato Quantit individuale bassa il limite di quantit in Compound Details stato superato I picchi che non corrispondono a nessun composto riportato sulla tavola di calibrazione sono elencati in una tavola separata con il nome di composti non calibrati Conoscere il modulo di valutazione spettri ChemStation Agilent per sistemi LC 3D Conoscere il modulo di valutazione spettri 3 Valutazione della purezza dei picchi Valutazione del
43. glia Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Rosso Fattori di corrispondenza al di sotto della soglia usati per i calcoli della purezza Blu Fattori di corrispondenza al di sotto della soglia non utilizzati per il calcolo della purezza A Livello di purezza 995 6 90 degli spettri B Livello di purezza 986 5 60 degli spettri C Livello di purezza 988 6 30 degli spettri D Livello di purezza 986 5 60 degli spettri X Fattori di corrispondenza usati per calcolare il livello di purezza O Fattori di corrispondenza non usati per calcolare il livello di purezza Gli esempi sopra riportati illustrano diversi metodi utilizzati per il calcolo del livello di purezza e L esempio A mostra solo un punto della curva di similarit al di sotto della soglia di 990 In questo caso il livello di purezza viene calcolato utilizzando i nove punti della curva 90 al di sopra della soglia L esempio B mostra sei punti adiacenti che giacciono al di sotto della soglia Il livello di purezza viene calcolato come media di questi sei fattori di corrispondenza L esempio C mostra quattro punti di dati che giacciono al di sotto della soglia ma solo tre di essi sono adiacenti Il livello di purezza viene calcolato come media di tre fattori di corrispondenza adiacenti e L esempio D mostra due gruppi di tre punti adiacenti al di sotto della soglia Il livell
44. i con cognizione 46 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 La ChemStation ha tre modalit di visualizzazione per le curve di similarit e di soglia 1 Senza trasformazioni vedere Figura 12 a 2 Come logaritmo naturale ln vedere Figura 12 b con il vantaggio di maggiori dettagli per l apice del picco nella parte inferiore del grafico 1000 similarity 1000 threshold Per un picco puro dal punto di vista degli spettri i valori del rapporto sono al di sotto dell unit mentre per i picchi impuri sono al di sopra dell unit Il vantaggio di questa modalit sta nell avere solo una linea visualizzata per consentire un interpretazione pi agevole 3 Come rapporto ratio vedere Figura 12 c a come calcolato b come logaritmo naturale c come rapporto Curva di soglia In soglia In similarit gt 995 Curva di similarit 995 a A 1000 1000 0 Figura 12 Curve di soglia e di similarit a come calcolato b n soglia e similarit e c come un rapporto Conoscere il modulo di valutazione spettri 47 3 Valutazione della purezza dei picchi Utilizzo dell analisi di purezza dei picchi 48 Le sezioni che seguono forniscono un esempio di impostazione per le finestre di dialogo Purity Preferences e Advanced Purity Preferences Acquisizione degli spettri La verifica della purezza de
45. i identificare tutti i picchi rilevati dall integratore all interno della finestra dei tempi di ritenzione specificata per le voci della biblioteca e nei modelli di ricerca La finestra relativa al tempo di ritenzione viene stabilita come parte del metodo di ricerca e NON presa dalla tavola di calibrazione Per l identificazione vengono usati solo quei picchi per i quali il tempo di ritenzione corrisponde a quello stabilito per la finestra Quando si trova Conoscere il modulo di valutazione spettri 19 2 20 Biblioteche di spettri una corrispondenza che supera la soglia stabilita si dice che il picco stato identificato La quantificazione procede basandosi sul nome di quel composto sulla tavola di calibrazione Se il composto esiste sia nella biblioteca sia sulla tavola di calibrazione si dice che stato identificato e calibrato se invece non sulla tavola di calibrazione si dice non calibrato Si consiglia questa modalit quando esistono biblioteche che contengono gruppi di composti specifici Ad esempio una biblioteca pu contenere le vitamine solubili in acqua o le vitamine solubili in grassi quindi possibile cercare il cromatogramma di questi composti particolari Se il cromatogramma contiene molti composti e la biblioteca ne contiene pochi questa modalit di ricerca da preferire alla prima Controllo della purezza dei picchi Questo tipo di controllo facoltativo Consigliamo di usarlo prima della ricerca in bib
46. i picchi si basa sulla comparazione di spettri sul picco Assicurarsi che ci siano abbastanza spettri a disposizione per effettuare una comparazione e che la loro qualit sia elevata Assicurarsi che il rivelatore sia in buone condizioni che l intensit della lampada sia forte e che sia stata scelta la cella di flusso con la fenditura adatta In genere meglio ottimizzare la sensibilit piuttosto che la risoluzione perch anche piccoli spostamenti di spettri vengono espressi su intervalli di lunghezze d onda molto ampi mentre la risoluzione non cos importante Utilizzare Store All per raccogliere spettri continuamente I rivelatori pi recenti supportano la modalit All in Peak in grado di raccogliere spettri di continuo quando un picco viene rivelato e di archiviare inoltre circa 20 spettri all inizio dell analisi perch possano essere utilizzati per determinare il rumore della linea di base nelle analisi di purezza Impostare l ampiezza del picco sullo schermo del rivelatore a serie di diodi secondo l ampiezza del picco pi stretto dell analisi che interessa Assicurarsi che la concentrazione del campione sia adatta per l intervallo di funzionamento lineare del rivelatore Se un componente troppo concentrato il rivelatore funzioner al di fuori del suo intervallo lineare alle lunghezze d onda di maggiore assorbanza e rimarr lineare sulle altre lunghezze d onda Ci causa una modifica della forma degli spet
47. i questi spettri nella finestra relativa alla purezza vengono rappresentati sotto forma di punti singoli Il valore di purezza viene calcolato come media di tutti i fattori di corrispondenza calcolati Classificazione di picco come puro o impuro Il livello di purezza calcolato viene utilizzato per produrre una dichiarazione di purezza visualizzata sullo schermo Se il fattore di purezza rientra nella soglia stabilito manualmente o calcolato dalla curva di soglia il picco viene classificato come puro Se il fattore di purezza supera il valore della soglia il picco viene classificato come impuro L impurezza rivelata un impurezza spettrale che non comporta necessariamente impurezza del composto Le impurezze spettrali possono essere provocate da modifiche della composizione del solvente gradienti o verificarsi in picchi non separtati alla linea di base Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Informazioni sulla purezza dei picchi Purity Il fattore di purezza fornisce un valore numerico per la purezza del picco e Se il picco stato classificato come puro il fattore di purezza il valore della media di tutti gli spettri che si trovano entro la soglia e Se il picco stato classificato come impuro il fattore di purezza il valore della media di tutti gli spettri che superano la soglia In entrambi i casi vengono specificati il numero di spettri utilizzati per il calcolo d
48. iene selezionata il test paragona sempre lo spettro corrente a tutti gli spettri del picco ed utilizza tutti i risultati per determinare la purezza Deve essere scelta una soglia per decidere se la corrispondenza di purezza per uno spettro dato valida Nel passato la corrispondenza doveva essere determinata in modo empirico a partire da materiale di riferimento Tuttavia questo tipo di approccio comporta una serie di problemi dato che la soglia cambia a seconda del rapporto segnale rumore Ci significa che appena cambia la dimensione del picco cambia anche la soglia Scegliendo Include Threshold Curve il software calcola automaticamente una soglia adatta per ogni spettro del picco basandosi sul rapporto segnale rumore Spectra per Peak Utilizzare questa funzione per scegliere quanti spettri devono essere sovrapposti e come devono essere selezionati Se ogni spettro viene paragonato ad uno spettro medio controlla la selezione degli spettri per la media Set By User inizia con il primo spettro da entrambi le parti del picco che supera la soglia di assorbanza e distribuisce i rimanenti alternativamente sul picco Se si utilizza una selezione automatica di spettri viene selezionato un numero dispari di spettri che inizia dallo spettro dell apice I rimanenti spettri vengono quindi selezionati sul picco a seconda della sua ampiezza e simmetria Scegliendo Set By User si sicuri di utilizzare tutti gli spettri fino ai bordi del picco I
49. iferimento sono disponibili per compatibilit con software esistente in modo da fornire informazioni sulla purezza anche se sono stati raccolti solo pochi spettri Se due picchi non sono completamente separati alla linea di base la selezione automatica di spettri di riferimento utilizzando Peak Baseline pu condurre ad uno spettro di riferimento situato nella valle fra i due picchi Un picco non risolto non pu essere puro In questo caso deve essere utilizzato un test di purezza per verificare l esistenza di componenti nascosti Utilizzare un riferimento manuale per scegliere uno spettro di riferimento prima e dopo il gruppo di picchi Wavelenght Range Utilizzare questa impostazione per controllare la parte di intervallo usata per le analisi di purezza possibile impostare un limite basso per escludere per esempio lunghezze d onda dove l assorbanza della fase mobile causa un eccesso di rumore Un limite elevato pu invece essere impostato per escludere lunghezze d onda superiori alle quali il composto che interessa non assorba Conoscere il modulo di valutazione spettri 49 3 50 Valutazione della purezza dei picchi Purity Display possibile specificare come viene calcolata la purezza e quali informazioni sono comprese nella visualizzazione Consigliamo di scegliere tutte le opzioni tranne Signal Ratios Le due pi importanti sono Draw amp Use Similarity Curve e Include Threshold Curve Quando la curva di similarit v
50. ificare i parametri per il calcolo del rumore di fondo La modifica dei parametri di calcolo del rumore di fondo pu avere effetti significativi sui risultati dei calcoli di purezza Assicurarsi di aver compreso correttamente le informazioni contenute in Advanced Peak Purity Options a pagina 81 prima di effettuare qualsiasi modifica Purity Curve Le informazioni contenute in Purity Curve illustrano i risultati della comparazione di ogni spettro del picco con lo spettro medio I valori riportati nella colonna Difference rappresentano la differenza aritmetica fra i valori riportati nella colonna Purity e quelli della colonna Threshold Il valore di Difference viene utilizzato per determinare quali spettri vengono utilizzati per il calcolo del fattore di purezza Purity e del valore di soglia Threshold per ogni picco More Purity Curves Le informazioni contenute in More Purity Curves illustrano i risultati dei calcoli della purezza utilizzando gli spettri anteriore dell apice e di coda oltre allo spettro medio vedere Utilizzo di spettri specifici a pagina 37 Si pu anche scegliere di visualizzare le curve di similarit per uno qualsiasi o tutti questi calcoli Inoltre si possono modificare i parametri per il calcolo della purezza e le modalit di visualizzazione dei risultati La modifica dei parametri per il calcolo della purezza pu avere effetti significativi sui risultati della purezza Assicurarsi di aver compreso co
51. imilarit Nella finestra di dialogo Advanced Purity Options possibile scegliere se visualizzare la curva di similarit come rapporto fra i valori di similarit ed di soglia Vedere anche Curve di threshold a pagina 45 Per i punti impuri il rapporto ha un valore superiore ad 1 mentre per i punti puri il rapporto ha un valore inferiore ad 1 36 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Utilizzo di spettri specifici La ChemStation consente di calcolare il fattore di purezza e le curve di similarit relativi a spettri diversi presi come obiettivo come illustrato dalla In generale l opzione Compare the Average Spectrum fornisce i dati migliori per la maggior parte delle impurezze sconosciute La flessibilit di poter scegliere uno spettro specifico come obiettivo estremamente utile nei casi in cui l analista deve supporre dove si trova l impurezza o ha bisogno di migliorare la sensibilit durante la valutazione della purezza Un esempio pu aiutare a capire come sia possibile applicare questo principio se si presuppone che l impurezza si trovi in coda al picco selezionando lo spettro di coda o dell apice e paragonandolo a tutti gli altri spettri si otterranno le informazioni pi significative in questo caso Picco con il 2 di impurezza i xi 1 o Rapporto fra lo spettro Rapporto fra lo Rapporto fra lo Rapporto fra lo frontale e tutti gli altri spettro e
52. ione del componente che passa attraverso la cella del rivelatore durante l eluizione Gli spettri vengono acquisiti ad esempio sulla curva ascendente all apice e sulla curva discendente del picco Gli spettri vengono normalizzati e sovrapposti per la presentazione grafica Questa tecnica valida per la valutazione di dati interattivi ed adattata anche alle analisi di routine Se un fattore numerico viene preferito in alternativa gli spettri che si trovano sull inclinazione ascendente e discendente possono essere paragonati matematicamente ed il fattore di purezza stampato per ogni picco con il relativo tempo di ritenzione La Figura 4 illustra un esempio nel quale gli spettri sono stati acquisiti sulla curva ascendente all apice e sulla curva discendente dei picchi e quindi normalizzati La comparazione visiva e il fattore di purezza calcolato con il software mostrano la differenza fra picco puro e picco impuro wh Va 200 400 2000 l 400 l N A A T T T T 7B Pu B B Bea en Figura 4 Controllo della purezza dei picchi mediante sovrapposizione di spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri 29 3 Valutazione della purezza dei picchi Purezza dei picchi Tecnica 1 Normalizzazione di spettri Per una precisione ancora maggiore la ChemStation Agilent pu calcolare i fattori di corrispondenza della purezza di 3 5 7 9 o di tutti gli spettri del picco 30 Conoscere il modulo di val
53. iore accuratezza pu essere ottenuta quando la deviazione standard viene calcolata da un numero di scansioni specificate Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Come utilizzare l analisi della purezza dei picchi Le sezioni che seguono forniscono un esempio di impostazione per le finestre di dialogo Purity Preferences e Advanced Purity Preferences Acquisizione degli spettri La verifica della purezza dei picchi si basa sulla comparazione di spettri sul picco Assicurarsi di avere a disposizione abbastanza spettri per una comparazione e che la qualit degli spettri sia elevata Assicurarsi che il rivelatore sia in buone condizioni che l intensit della lampada sia elevata e di aver scelto la cella di flusso e la slitta adatte In genere bisognerebbe ottimizzare la sensibilit piuttosto che la risoluzione dato che spostamenti anche molto ridotti degli spettri si ripercuotono su intervalli di lunghezze d onda molto ampi mentre la risoluzione non in genere cos importante Utilizzare Store All per raccogliere spettri continuamente I rivelatori pi recenti supportano la modalit All in Peak in grado di raccogliere spettri di continuo quando un picco viene rivelato e di archiviare inoltre circa 20 spettri all inizio dell analisi perch possano essere utilizzati per determinare il rumore della linea di base nelle analisi di purezza Impostare l ampiezza del picco sullo schermo del r
54. ipo di ricerca riferirsi al sistema di help online o a quello di apprendimento integrato Valutazione della purezza dei picchi Questo capitolo descrive il procedimento di valutazione della purezza del picco per le versioni di software A 04 0x e precedenti e per le versioni A 05 0x Conoscere il modulo di valutazione spettri Sommario 1 Conoscere l analisis degli specttri 9 Definizione dell analisi di spettri 10 Determinazione della lunghezza d onda ottimale 12 Stili di rapporti relativi a spettri 15 2 Biblioteche di spettri 17 Metodi di ricerca 18 Descrizione del rapporto 21 Contrassegni di purezza 21 Contrassegno di corrispondenza in biblioteca 22 Contrassegno di nome del composto 22 Contrassegni di quantit 22 3 Valutazione della purezza dei picchi 23 Valutazione della purezza dei picchi A 04 0x e precedenti 24 Controllo della purezza dei picchi 25 Che cos un controllo della purezza del picco 25 Il fattore di corrispondenza 26 Tecniche di purezza dei picchi 27 Purezza dei picchi Tecnica 1 Normalizzazione di spettri 29 Correzione del disturbo di fondo tramite selezione di uno spettro di riferimento 31 Purezza dei picchi Tecnica 2 Produzione di raziogrammi 32 Uso del diagramma di rapporto tra segnali 32 Raziogramma 33 Conoscere il modulo di valutazione spettri Sommario Purezza dei picchi Tecnica 3 Curve di similarit spettrale 35 Curva di similarit visualizzata come soglia similarit 36 Util
55. ivelatore a serie di diodi secondo l ampiezza del picco pi stretto dell analisi che interessa Assicurarsi che la concentrazione del campione sia adatta per l intervallo di funzionamento lineare del rivelatore Se un componente troppo concentrato il rivelatore funzioner al di fuori del suo intervallo lineare alle lunghezze d onda di maggiore assorbanza e rimarr lineare ad altre lunghezze d onda Ci modificher la forma degli spettri a seconda della concentrazione ed il composto sar considerato impuro Se la concentrazione del composto troppo bassa il rapporto segnale rumore relativo agli spettri sar scarso e la sensibilit dell analisi della purezza risulter ridotta L analisi di purezza pi accurata e sensibile quella dei picchi da 250 a 800 mAU di altezza Utilizzare le impostazioni di default per il controllo della purezza dei picchi Se viene rilevata una possibile impurezza possibile considerare in modo pi critico i risultati per confermare l impurezza e caratterizzarla ulteriormente Conoscere il modulo di valutazione spettri 83 3 84 Valutazione della purezza dei picchi Impostazione delle opzioni relative alla purezza Selezionare le impostazioni che seguone nelle tavole relative della fienestra di dialogo Purity Options Intervallo di lunghezze d onda Utilizzare questa impostazione per controllare la parte di intervallo usata per le analisi di purezza possibile impostare un limite
56. izzo di spettri specifici 37 Calcoli sulla purezza 39 No similarity curve selected nessuna curva di similarit scelta 39 Similarity Curve Selected scelta curva di similarit 40 Inserimento della curva di soglia 42 Classificazione di picco come puro o impuro 43 Layout of the Peak Signals Window 44 Curve di threshold 45 Utilizzo dell analisi di purezza dei picchi 48 Acquisizione degli spettri 48 Impostazione delle opzioni di purezza 49 Impostazione delle opzioni avanzate 51 Come caratterizzare meglio i picchi impuri 54 Risultati errati 55 Impostazioni consigliate 57 Esempio n 1 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco con curve di similarit Modalit automatica 57 Esempio n 2 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco con curve di similarit Interpretazione manuale 59 Esempio n 3 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco senza curve di similarit 61 Esempio n 4 Spettri acquisiti in modo Peak Controlled 62 Valutazione della purezza dei picchi A 05 0x 64 Controllo della purezza del picco 65 Che cos un controllo della purezza dei picchi 65 Il fattore di corrispondenza 66 Correzione del disturbo di fondo tramite selezione di uno spettro di riferimento 68 Tecniche di purezza dei picchi 69 Conoscere il modulo di valutazione spettri Visualizzazione della purezza dei picchi 70 Finestra di spettri Normalizzazione di spettri Finestra della purezza Curve di similarit fra spettri
57. l livello di purezza O Fattori di corrispondenza non usati per calcolare il livello di purezza Nell esempio B due dei quattro fattori di corrispondenza 50 sono al di sotto della soglia Il valore della purezza calcolato come media di questi due fattori di corrispondenza Similarity Curve Selected scelta curva di similarit Nero Usare questa funzione per i file creati con All Spectra Il fattore di corrispondenza di tutti gli spettri registrati nel picco e lo spettro o gli spettri specificati in Purity Level Calculated With ad esempio di media apice parte anteriore ecc vengono calcolati e visualizzati come curva di similarit nella finestra relativa ai segnali del picco del display relativo alla purezza dei picchi Quando pi di due fattori di corrispondenza adiacenti sono al di sotto della soglia il valore della purezza viene calcolato come media di tutte le sezioni delle curve di similarit con pi di due fattori di corrispondenza adiacenti al di sotto della soglia Se ci sono due o meno fattori di corrispondenza adiacenti al di sotto della soglia il valore della purezza viene calcolato come media di tutti i fattori di corrispondenza al di sopra della soglia Tutti gli spettri usati per calcolare le curve di similarit sono contrassegnati in fondo alla finestra Peak Signals dal segno Questi segni si differenziano a seconda del colore come segue Fattori di corrispondenza al di sopra della so
58. l tipo Baseline a sinistra e a destra del picco scelto vengono presi come spettri di riferimento di sinistra e di destra Quando non si trova nessuno spettro sulla linea di base di sinistra n di destra si prende come riferimento il primo e l ultimo spettro dal file Usare questa modalit quando tutti gli spettri sono nel file di dati spettrali Linea di base pi vicina Viene scelto uno spettro di riferimento sul punto della linea di base pi vicino al picco scelto e sottratto dallo spettro selezionato Conoscere il modulo di valutazione spettri 31 3 Valutazione della purezza dei picchi Purezza dei picchi Tecnica 2 Produzione di raziogrammi 32 Uso del diagramma di rapporto tra segnali La tecnica usata per calcolare il rapporto di assorbanza basata sul tracciamento del rapporto di assorbanze a due o pi lunghezze d onda sul profilo di eluizione Per un composto puro il coefficiente di estinzione A ad una lunghezza d onda direttamente proporzionale a quello di qualsiasi altra lunghezza d onda Ao AQ K x AQ dove la costante K caratteristica del composto alle lunghezze d onda selezionate Il rapporto di assorbanza fra le due lunghezze d onda risulta costante per un composto puro Una rappresentazione grafica del rapporto di assorbanza rispetto al tempo di ritenzione dar una funzione dell onda al quadrato con un ampiezza K La presenza di un picco di impurezza che coeluisce con un valore
59. la Figura 2 Assorbanza Lunghezza d onda nm Assorbanza Time Figura 2 Diagramma di isoassorbanza 12 Conoscere il modulo di valutazione spettri Conoscere l analisis degli specttri 1 Questa tecnica molo utile per lo sviluppo di metodi per trovare la lunghezza d onda ottimale di rivelazione per ogni singolo picco La lunghezza d onda corrisponde alla posizione orizzontale del cursore nel diagramma di isoassorbanza Quando il cursore viene spostato lungo l asse della lunghezza d onda il cromatogramma viene ricostruito nella finestra in basso vedere Figura 2 Per trovare la lunghezza d onda ottimale di rivelazione di un picco necessario effettuare le operazioni che seguono e Spostare il cursore orizzontale nel modo Quick View al centro dello schermo finch l assorbanza del picco di interesse risulti pi alta possibile e ci sia una buona separazione cromatografica sulla finestra in basso e Selezionare il modo Signal View e ottimizzare l ampiezza della banda per aumentare il rapporto segnale rumore al fine di ottenere la lunghezza d onda ottimale per la rivelazione Il segnale e l ampiezza scelti possono essere trasferiti alla finestra relativa al segnale nel modo di analisi dei dati facendo click sul tasto Copy Il segnale e l ampiezza della banda possono essere usati per verificare l integrazi
60. la abbia uno spettro di massa che lo distingue con valori m z esclusivi oppure che i componenti siano abbastanza ben separati da consentire la determinazione di massimi multipli e Il rapporto segnale rumore sia abbastanza elevato da consentire ai massimi reali di essere identificati senza ambiguit e I tempi di ritenzione degli ioni che vengono utilizzati come base per il calcolo dei tempi di ritenzione dei componenti siano precisi e significativi Con una sola e rara eccezione la ionizzazione ad elettrospray ESI produce solo ioni molecolari a meno che non venga utilizzata una dissociazione della fonte di ioni indotta da collisione CID per produrre frammenti Ci significa che se due ioni distinti caricati singolarmente si trovano in una serie di spettri anche se co eluiscono comunque possibile identificarli e quantificarli necessario prestare molta attenzione nel compiere questa operazione dato che addotti di cationi ed anioni possono generare altri ioni M H o M H oltre a quelli previsti La ionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI produce anch essa ioni molecolari ma i frammenti termici sono pi frequenti in APCI che usando elettrospray Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Inoltre uno spettro di massa contiene informazioni sugli isotopi che possono essere utilizzate per l identificazione o per stabilire la purezza L algoritmo di purezza del picco identifiche
61. la purezza dei picchi A 04 0x e precedenti Controllo della purezza dei picchi 25 Purezza dei picchi Tecnica 1 Normalizzazione di spettri 29 Purezza dei picchi Tecnica 2 Produzione di raziogrammi 32 Purezza dei picchi Tecnica 3 Curve di similarit spettrale 35 Calcoli sulla purezza 39 Curve di threshold 45 Utilizzo dell analisi di purezza dei picchi 48 Impostazioni consigliate 57 Valutazione della purezza dei picchi A 05 0x 64 Controllo della purezza del picco 65 Visualizzazione della purezza dei picchi 70 Come utilizzare l analisi della purezza dei picchi 83 Purezza degli spettri di massa dei picchi 86 Hg Agilent Technologies 23 3 Valutazione della purezza dei picchi Valutazione della purezza dei picchi A 04 0x e precedenti Questa sezione descrive i metodi da utilizzare per valutare la purezza di un picco e Controllo della purezza dei picchi e Purezza dei picchi Tecnica 1 Normalizzazione di spettri e Purezza dei picchi Tecnica 2 Produzione di raziogrammi e Purezza dei picchi Tecnica 3 Curve di similarit spettrale e Calcoli sulla purezza e Curve di threshold e Utilizzo dell analisi di purezza dei picchi e Impostazioni consigliate 24 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Controllo della purezza dei picchi Una domanda importante per qualsiasi analisi cromatografica se il picco contiene uno o
62. lent Essi completano le informazioni contenute nel manuale Conoscere la ChemStation Agilent con concetti specifici relativi a spettri applicabili sulla ChemStation Agilent per sistemi LC 3D e sulla ChemStation Agilent per sistemi CE Per una spiegazione dettagliata su come installare e configurare il modulo di valutazione spettri con una ChemStation per sistemi LC 2D consultare il manuale Installazione della ChemStation Hp su sistemi LC 1 Conoscerel analisis degli specttri Questo capitolo tratta gli argomenti che seguono e Definizione dell analisi di spettri e Determinazione della lunghezza d onda ottimale di rivelazione e Stili di bollettino 2 Biblioteche di spettri I sistemi di dati tradizionali quantificano i composti rivelati da correlazioni basate sui tempi di ritenzione Ci pu provocare errori di identificazione se e Nella finestra relativa al tempo di ritenzione specificato compaiono composti diversi da quelli calibrati e Nella finestra dei tempi di ritenzione specificata compare pi di un picco e Il composto ritenuto nella colonna pi a lungo di quanto previsto nella finestra specificata a causa di variazioni di flusso del solvente o ancora pi frequentemente a causa di variazioni delle caratteristiche della colonna Un modo di evitare questo tipo di errori consiste nell uso di qualificatori del picco come descritto nel manuale Conoscere la ChemStation Agilent Con un rivelatore a serie di diodi
63. lioteca poich l affidabilit del riconoscimento spettrale funzione della qualit della separazione La Chemstation paragona la coerenza degli spettri in diverse sezioni del picco Calcola e segnala un fattore di purezza La purezza pu essere definita da una soglia al di sotto della quale i risultati di dubbia qualit sono contrassegnati da una x nel bollettino Per una descrizione pi dettagliata della purezza dei picchi consultare Capitolo 3 Valutazione della purezza dei picchi Conoscere il modulo di valutazione spettri Biblioteche di spettri 2 Descrizione del rapporto Un bollettino tipo generato da una biblioteca di spettri comprende Cromatogramma elettroferogramma e relativi tempi di ritenzion migrazione Titolo con informazioni sul nome del file ed i parametri di ricerca Descrizione del segnale del rivelatore e due tavole di analisi Tempi di ritenzione dei picchi ottenuti con l analisi Tempi di ritenzione delle possibili corrispondenze presenti in biblioteca Tempi di ritenzione riportati sulla tavola di calibrazione Quantit e fattore di purezza se scelto unitamente a numero di inserimento in biblioteca fattore di corrispondenza in biblioteca nome del composto Per segnalare il livello di purezza la corrispondenza con spettri in biblioteca ed il nome vengono usati contrassegni su colonne diverse del bollettino Questi contrassegni possono essere interpretati come segue Contrassegni di pur
64. mazioni sugli spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri Conoscere l analisis degli specttri 1 Rivelatore a serie di diodi UV visibile Il rivelatore a serie di diodi UV Visibile consente di acquisire continuamente spettri nel campo UV visibile dello spettro dato che il rivelatore a serie di diodi acquisisce dati a tutte le lunghezze d onda contemporaneamente non c perdita di sensibilit durante l acquisizione di spettri Rivelatore a fluorescenza Il rivelatore a fluorescenza consente di raccogliere dati sugli spettri in tre modi diversi possibile impostare una lunghezza d onda di eccitazione fissa e raccogliere gli spettri di emissione possibile impostare una lunghezza d onda di emissione fissa e raccogliere gli spettri di eccitazione e si pu effettuare una scansione di fluorescenza nella quale sia la lunghezza d onda di eccitazione sia la lunghezza d onda di emissione vengono variate per ottenere una caratterizzazione tridimensionale del campione Gli spettri di eccitazione e di emissione possono essere acquisiti durante la cromatografia ma dato che il rivelatore a fluorescenza un rivelatore di scansione maggiore il numero di lunghezze d onda acquisite maggiore l intervallo di scansione minore sar la sensibilit dell analisi La scansione a fluorescenza tridimensionale deve essere acquisita in modalit di interruzione del flusso oppure off line dato che richiede una concentrazione di
65. milarit e di soglia La ChemStation ha tre modi di visualizzare le curve di similarit e di soglia 1 Senza trasformazioni vedere la Figura 25 a 2 Come logaritmo naturale ln vedere la Figura 25 b con il vantaggio di maggiori dettagli sull apice del picco nella parte inferiore del grafico 1000 similarity 10002 threshold TEA 25 c 3 Come rapporto ratio Conoscere il modulo di valutazione spettri 81 3 82 Valutazione della purezza dei picchi Per un picco puro dal punto di vista degli spettri i valori del rapporto sono al di sotto dell unit mentre per i picchi impuri sono al di sopra dell unit Il vantaggio di questa modalit sta nell avere solo una linea visualizzata per consentire un interpretazione pi agevole a come calcolato b come logaritmo naturale c come rapporto In soglia Curva di soglia In similarit 995 1000 1000 0 Figura 25 Curve di soglia e di similarit a come calcolato b n soglia e similarit e c come un rapporto Soglia del rumore La soglia del rumore determinata per default automaticamente utilizzando la deviazione standard di 14 spettri di rumore puri all inizio di un analisi 0 minuti possibile modificare l ora ed il numero di spettri dai quali la deviazione standard del rumore sar calcolata oppure si pu iserire un valore prefissato per la deviazione standard valore di default 0 1 Una migl
66. n genere quindici spettri sono sufficienti per fornire una buona rappresentazione del picco La soglia stabilisce quanto piccolo pu essere uno spettro per l analisi Di solito viene impostato a 1 2 mAU per assicurarsi che anche i bordi vengano controllati Purity Se non si sceglie Include Threshold Curve la soglia di purezza deve esser usata per impostare manualmente il limite del test di purezza Una volta che la curva di threshold stata scelta il valore non viene utilizzato per i test di purezza Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Impostazione delle opzioni avanzate Signal Processing Queste impostazioni controllano semplicemente la visualizzazione del picco e dei segnali sullo schermo dei risultati relativi alla purezza Consigliamo di utilizzare le impostazioni predefinite Spectra Processing Consente di effettuare calcoli matematici per regolarizzare o accoppiare gli spettri In pratica qualunque cosa aumenti le piccole differenze fra spettri derivate aumenta il rumore mentre qualunque cosa riduca il rumore regolarizzazione diminuisce la sensibilit alle piccole modifiche Spectra Normalization Scegliere Match quando gli spettri sono molto simili e le concentrazioni variano di molto Scegliere lo stesso intervallo per la normalizzazione come l intervallo di lunghezze d onda Wavelenght Range specificato nella finestra di dialogo Purity Options Purity
67. n modo Peak Controlled Questa impostazione richiede molto spazio sul disco e produce risultati veloci ma meno accurati Impostazione raccomandata per Purity Preferences Spettro di riferimento Automatic Apex Wavelenght Range Come richiesto Purity Display Draw Spectra On Draw Spectral Difference On Draw amp Use Similarity Curve Off Include Treshold Curve Off Draw Signals On Stored in Data File Draw Signal Ratios Off Spectra per Peak Automatic All Purity Purity threshold 990 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Informazioni aggiuntive Reference Spectra Possono anche essere usati spettri di riferimento manuali con purezza dei picchi interattiva anche possibile usare la linea di base pi vicina se il file di dati contiene abbastanza spettri della linea di base Spectra per Peak Questi spettri vengono usati per calcoli sulla purezza dei picchi Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza dei picchi Soglia mAU dipende dal sistema da0 a 5 mAU Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza dei picchi Spettri con una scala di assorbanza inferiore a questo valore non vengono usati in calcoli sulla purezza Purity Usata per determinare picchi puri impuri Impostazione raccomandata per Advanced Purity Processo del segnale Scala temporale del segnale da visualizzare peak width 4 Absorbance threshold for signals mAU 2 Normalize Maximum
68. ntificazione del picco dato che normalmente influenza anche l altezza dell inizio e della fine del picco tale difetto pu essere eliminato correggendo la linea di base Gli assorbimenti di fondo si possono modificare utlizzando solventi diversi o cambiando la composizione del solvente durante un analisi Conoscere il modulo di valutazione spettri 25 3 26 Valutazione della purezza dei picchi Il fattore di corrispondenza La rivelazione delle impurezze dei picchi per comparazione visiva di spettri richiede molto tempo e non adatta ad operazioni automatizzate Sono disponibili numerose tecniche statistiche per la comparazione automatica di spettri Una di queste la comparazione matematica fra due spettri Si tratta del calcolo di un fattore di corrispondenza che rappresenta il grado di similarit fra spettri La comparazione fra spettri d un fattore di corrispondenza definito come 10 x z ELI l I valori x e y sono le assorbanze misurate rispettivamente nel primo e nel secondo spettro alla stessa lunghezza d onda n il numero di punti di dati ed la somma dei dati Come limiti estremi un fattore di corrispondenza di 0 indica la mancanza di corrispondenza ed uno di 1000 indica spettri identici Generalmente un valore al di sopra di 990 indica che gli spettri sono simili Valori compresi fra 900 e 990 indicano l esistenza di una qualche similarit ma i risultati devono essere interpretati con cautela Tutti i valori
69. o di purezza viene calcolato come media di questi sei punti Conoscere il modulo di valutazione spettri 41 3 42 Valutazione della purezza dei picchi Inserimento della curva di soglia La curva di soglia illustra l effetto del rumore su di una curva di similarit data L effetto aumenta rapidamente avvicinandosi l inizio e alla fine del picco In pratica una curva di soglia una curva di similarit di un picco puro con una componente di rumore di fondo Inoltre il valore di soglia visualizzato nel campo contenente informazioni sulla purezza viene calcolato come media dei singoli valori di soglia per ogni spettro preso come campione ed utilizzati per calcolare il livello di purezza A B 1000 1000 c A Livello di purezza 988 6 30 degli spettri B Livello di purezza 986 5 60 degli spettri C Curve di soglia X Fattori di corrispondenza usati per calcolare il livello di purezza O Fattori di corrispondenza non usati per calcolare il livello di purezza Gli esempi qui riportati illustrano i diversi metodi utilizzati per calcolare il livello di purezza e Nell esempio A vengono utilizzati tre fattori di corrispondenza adiacenti al di sotto della soglia calcolata X per calcolare il livello di purezza dei picchi I valori di soglia di questi tre punti vengono utilizzati anche per calcolare il valore di soglia riportato nella finestra Purity Information e Nell esempio B entrambi i gruppi di tre fattori
70. o impurezze La purezza dei picchi pu essere determinata in modo interattivo da picco a picco per tutti i picchi di un certo file di dati oppure automaticamente alla fine di ogni analisi come parte del metodo nel caso si usi uno stile spettrale per il rapporto di stampa ad esempio detail spectrum possibile ottimizzare il processamento della purezza dei picchi in base alle prestazioni o all accuratezza impostando opzioni relative a e Intervallo di lunghezza d onda usato per determinare la purezza e Spettri di riferimento e Soglia di purezza e Processamento spettrale compresi i fattori logaritmici di regolarizzazione e di tracciatura curvilinea oltre all ordine della derivata e componenti della purezza calcolati e visualizzati comprendono gli spettri le differenze fra spettri le curve di similarit e di soglia Le tecniche da usare per valutare la purezza di un picco descritte nella sezione che segue comprendono e normalizzazione degli spettri comparazione di spettri normalizzati provenienti da diverse sezioni del picco e curva di similarit comparazione di uno spettro selezionato o di media a tutti gli altri spettri presi durante l eluizione del picco Conoscere il modulo di valutazione spettri 69 3 Valutazione della purezza dei picchi Visualizzazione della purezza dei picchi Finestra di spettri La finestra di spettri visualizza i cinque spettri utilizzati per calcolare lo spettro medio da
71. o integrato che contiene pi di un raggruppamento considerato impuro Visualizzazione della purezza degli spettri di massa Finestra lons per Peak La finestra Ions for Peak mostra i due valori m z con le abbondanze maggiori per ogni raggruppamento I picchi ad un solo componente presentano due ioni che raggiungono il massimo allo stesso tempo di ritenzione i picchi multicomponente presentano coppie di ioni che raggiungono il massimo allo stesso tempo di ritenzione Ogni coppia di ioni indica un componente del picco impuro Per esaminare in modo pi dettagliato gli ioni si possono utilizzare le funzioni grafiche della ChemStation Agilent Finestra MS Peak Purity Results La finestra MS Peak Purity Results contiene i risultati relativi alla purezza del picco in forma di tavola Ogni linea della tavola contiene informazioni per un componente numero di scansione medio interpolato ed i due ioni pi abbondanti Conoscere il modulo di valutazione spettri Indice A acquisizione di spettri 48 83 assorbanza rapporto 33 assorbanza di fondo 55 C calcoli di purezza curva di soglia 78 calcoli di purezza dei picchi iserimento della curva di soglia 42 calcoli sugli spettri 51 calcoli sulla purezza curva di soglia 73 spettrale di massa 87 calcolo del livello di purezza 39 curva di somiglianza come soglia 36 no similarity curve selected nessuna curva di similarit scelta 39 scelta curva di similarit 40 COMPARAZI
72. o lo spettro medio contiene un contributo dell impurezza maggiore rispetto allo spettro all apice con una maggiore impurezza sul fronte dell eluizione o della migrazione ed un impurezza minore alla coda rispetto alla curva di rapporto dello spettro all apice Il profilo di similarit soglia e curve di rapporto dipende dalla posizione dal livello e dalle differenze fra spettri dell impurezza e quindi non possibile fornire informazioni generali sulla forma Bisogna aspettarsi profili diversi a seconda della situazione Visualizzazione dei calcoli sulla purezza Il fattore di purezza non una misura assoluta della purezza del picco una funzione dei parametri utilizzati nei calcoli specialmente della soglia di purezza Quindi i risultati devono essere interpretati a seconda della soglia stabilita Per i picchi puri possono essere prodotti risultati comparabili anche a partire da diverse impostazioni dei parametri Per i picchi impuri l analisi risulta un p pi difficoltosa Per il calcolo vengono considerati solo punti di dati che si riferiscono ad un impurezza ad esempio spettri che giacciono al di sotto della soglia quindi una modifica del valore di soglia pu influenzare drasticamente il fattore di purezza per un picco impuro Per ulteriori dettagli sui calcoli consultare i parametri che seguono Per una descrizione dettagliata delle curve di similarit della ChemStation vedere Finestra di spettri a pagina 70
73. olarizzare tutti gli spettri con lo stesso filtro prima di effettuare comparazioni Curvatura di spettri Se sono stati acquisiti spettri ad una risoluzione bassa si pu usare la curvatura per far s che lo spettro sia pi simile ad una linea curva che a un poligono Questa operazione viene effettuata calcolando ulteriori punti di dati fra i dati originali dello spettro utilizzando funzioni trigonometriche Quando si utilizza la curvatura degli spettri i punti di dati originali vengono conservati Spettri logaritmici Gli spettri logaritmici comprimono la scala di assorbanza Possono rivelarsi molto utili quando le assorbanze coprono un intervallo molto vasto Conoscere il modulo di valutazione spettri 67 3 Valutazione della purezza dei picchi Spettri in derivata Le derivate di spettri rivelano particolari pi specifici rispetto agli spettri originali quando si paragonano composti diversi Piccole differenze fra spettri sono molto pi evidenti e facili da identificare visivamente Tuttavia il rumore viene aumentato limitando cos l uso degli spettri in derivata Correzione del disturbo di fondo tramite selezione di uno spettro di riferimento Sono disponibili diversi tipi di correzione per estrarre spettri del picco da file di dati per effettuare correzioni del fondo Scelta manuale del riferimento Quando viene scelto uno spettro di riferimento quest ultimo viene preso in un momento stabilito dal file di dati e sottra
74. one l identificazione ed il processo di quantificazione L ottimizzazione della lunghezza d onda tramite rivelatore a fluorescenza richiede generalmente due esecuzioni e Impostare una lunghezza d onda di eccitazione nel basso campo UV da 230 a 250 nm e raccogliere gli spettri di emissione Per ogni picco del cromatogramma determinare la lunghezza d onda di emissione ottimale utilizzando un diagramma di isoassorbanza Preparare una tavola di programmazione per impostare la lunghezza d onda di emissione ottimale per ogni picco appena eluisce quindi raccogliere gli spettri di eccitazione Spettro di fluorescenza Il diagramma di isoassorbanza tridimensionale viene usato per visualizzare spettri ottenuti solo da scansioni a fluorescenza In questo caso le informazioni sugli spettri vengono rappresentate graficamente sul piano lunghezza d onda di eccitazione lunghezza d onda di emissione Non c asse di tempo dato che la scansione a fluorescenza viene acquisita in modalit di flusso interrotto oppure offline A partire dal diagramma di isoassorbanza si possono estrarre spettri di eccitazione o di emissione a qualsiasi lunghezza Conoscere il modulo di valutazione spettri 13 1 Conoscere l analisis degli specttri d onda gli spettri di eccitazione sono riportati al di sopra del diagramma di isoassorbanza cursore verticale gli spettri di emissione compaiono invece al di sotto del diagramma di isoassorbanza cursore orizzontale
75. osi l inizio e alla fine del picco Una curva di soglia pu essere considerata come curva di similarit per un picco puro con un contributo di rumore di fondo La Figura 11 a mostra sia la curva di similarit sia la curva di soglia per un picco puro con rumore di fondo la Figura 11 b per un picco impuro a Picco senza impurezze ma con rumore b Picco con impurezze e rumore 5 di impurezza 980 980 LZ Curva di soglia Curva di similarit Curva di similarit Curva di soglia 1000 1000 Rumore 0 1 mAU Spettro dell impurezza 1 mAU Figura 11 Finestra dei segnali del picco contenente curve di similarit e di soglia La soglia del rumore viene determinata automaticamente basandosi sulla deviazione standard di spettri di solo rumore ad un momento specifico con un numero di spettri scelto dall utente ed i valori di default della ChemStation Agilent stabiliti a 0 minuti con 14 spettri Nelle analisi che seguiranno si potr definire la soglia del rumore come valore fisso basato sull esperienza o su misurazioni precedenti La curva di soglia rappresentata da linee spezzate stabilisce i limiti entro i quali l impurezza spettrale rientra nei parametri di rumore stabiliti Al di sopra di questa soglia l impurezza spettrale supera il rumore di fondo e la curva di similarit si interseca con la curva di soglia indicando un impurezza ammesso che i parametri di riferimento e di rumore siano stati scelt
76. r Il fattore di corrispondenza influenzato da un certo numero di parametri che vengono determinati dal campione e dal metodo di separazione I fattori comprendono la specificit del campione l assorbimento spettrale dei Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 composti matrice e il livello di rumore spettrale unitamente all assorbimento di fondo e le deviazioni spettrali causate dal solvente e da strumenti diversi diversa calibrazione della lunghezza d onda Come rendere regolari gli spettri L affidabilit di un controllo della purezza limitata quando un rumore spettrale dello stesso ordine di grandezza dello spettro La regolarizzazione degli spettri funziona secondo le modalit che seguono 1 Perun numero definito di punti di dati per esempio 5 definito anche filtro viene utilizzata una regressione cubica per determinare un punto di dati nuovo 2 Ilfiltro si sposta in avanti di un punto prendendo gli ultimi quattro dei dati gi usati ed il punto aggiuntivo quindi ripetendo Utilizzando l algoritmo di regolarizzazione il rumore statistico pu essere ridotto rendendo l identificazione dello spettro regolarizzato pi affidabile L algoritmo di regolarizzazione pu anche cambiare il profilo di uno spettro dipendentemente dalla lunghezza del filtro cio dal numero di punti di dati utilizzati nell algoritmo di regolarizzazione in una sola volta Si consiglia di reg
77. r un picco impuro solo in presenza di differenze di spettri o di tempo L interpretazione manuale in grado di ottenere migliori risultati A differenza dei dati UV i dati MS possono essere utilizzati per quantificare i picchi impuri finch i composti hanno ioni diversi Per stabilire la purezza di solito sono necessari dati di scansione e non dati SIM perch risultino veramente utili Calcoli sulla purezza degli spettri di massa Un intervallo di TIC che copra l area integrata del picco viene ricercata utilizzando un gruppo di valori m z selezionati e viene determinata l abbondanza massima per ogni valore m z Per ogni massimo rilevato un tempo di ritenzione interpolato numero di scansioni viene calcolato utilizzando un adattamento parabolico I tempi di ritenzione dei massimi maggiori vengono raggruppati ed in seguito identificati come i componenti presenti in quell intervallo Vengono quindi fornite informazioni sul numero dei componenti sul tempo di ritenzione numero di scansione di ognuno e sui valori pi elevati m z contenuti nel raggruppamento Il gruppo di valori m z selezionato stato ottenuto esaminando le scansioni al 25 50 e 75 dell intervallo di tempo del picco integrato utilizzando tutti i valoril m z con abbondanza maggiore dell 1 dell abbondanza massima della scansione picco di base Per ogni valore m z selezionato l abbondanza media della prima e dell ultima scansione nell intervallo di tempo vengono utilizzat
78. ri della ChemStation Agilent Essi completano le informazioni contenute nel manuale Conoscere la ChemsStation Agilent con concetti specifici relativi a spettri applicabili sulla ChemStation Agilent per sistemi LC 3D e sulla ChemStation Agilent per sistemi CE Per una spiegazione dettagliata su come installare e configurare il modulo di valutazione spettri con una ChemStation per sistemi LC 2D consultare il manuale Installazione della ChemsStation Hp su sistemi LC Agilent Technologies Deutschland GmbH 2003 Printed in Germany 06 03 E DE Agilent Technologies
79. rrettamente le informazioni riportate in Advanced Peak Purity Options a pagina 81 prima di procedere a qualsiasi modifica Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Advanced Peak Purity Options Le modifiche apportate nella finestra Advanced Peak Purity Options possono influenzare in maniera significativa i risultati della purezza Consigliamo di non apportare nessuna modifica senza conoscere alla perfezione gli effetti che le modifiche possono provocare sui risultati Calcoli sulla purezza I calcoli sulla purezza utilizzano per default la media di cinque spettri presi sul picco vedere Controllo della purezza del picco a pagina 65 tuttavia si possono utilizzare altri spettri come base per il calcolo All peak spectra utilizza ognuno dei cinque spettri scelti per produrre cinque gruppi di risultati visualizzati nella stessa finestra Apex spectrum Front spectrum e Tail spectrum usano spettri specifici che consentono di migliorare la sensibilit dell analisi della purezza vedere Utilizzo di spettri specifici a pagina 37 Front amp Tail spectrum illustra i due gruppi di risultati prodotti utilizzando gli spettri anteriore e di coda come base per il calcolo della purezza La visualizzazione di default della purezza del picco il fattore di purezza come illustrato nella Figura 20 tuttavia anche possibile visualizzare i risultati sulla purezza sotto forma di curve di si
80. tation vedere Soglia di purezza a pagina 85 No similarity curve selected nessuna curva di similarit scelta Usare questa impostazione per file generati con Peak Controlled Spectra 1 I fattori di corrispondenza vengono calcolati per ogni spettro selezionato che compare nella finestra degli spettri del picco durante la visualizzazione della purezza e per lo spettro o gli spettri specificati alla voce Purity Level Calculated With ad esempio media apice parte anteriore ecc Se sono disponibili solo due spettri vengono comparati solo questi e si ignorano invece le impostazioni stabilite per il fattore di corrispondenza spettri di media apice anteriori o di coda 2 Se un valore al di sotto della soglia stabilita ad esempio 990 il valore della purezza si calcola come media di tutti i fattori di corrispondenza calcolati al di sotto della soglia In questo caso il picco gi stato identificato come impuro e solo gli spettri che si trovano al di sotto della soglia vengono utilizzati per stabilire il livello di impurezza If no value is Conoscere il modulo di valutazione spettri 39 3 40 Valutazione della purezza dei picchi below the threshold value the purity level is the mean value of all the calculated match factors A B X 1000 1000 x x x o 990 gt 990 x A Livello di purezza 995 6 100 degli spettri B Livello di purezza 986 5 50 degli spettri X Fattori di corrispondenza usati per calcolare i
81. te In caso di separato accordo scritto fra Agilent e l utente con diverse condizioni di garanzia relativamente al contenuto di questo documento in conflitto con le condizioni qui riportate prevarranno le condizioni dell accordo separato Licenze sulla tecnologia I componenti hardware e o software descritti in questo documento vengono forniti con licenza e possono essere utilizzati o copiati solo in conformit ai termini di tale licenza Indicazioni di sicurezza AVVERTENZA L indicazione AVVERTENZA segnala un rischio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita correttamente o non rispettata pu provocare danni al prodotto o la perdita di dati importanti Non eseguite mai alcuna operazione ignorando l AVVERTENZA fatelo solo dopo aver compreso e applicato completamente le indicazioni di Agilent ATTENZIONE L indicazione ATTENZIONE segnala un rischio serio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita correttamente o non rispettata pu provocare lesioni personali o morte Non eseguite mai alcuna operazione ignorando l indicazione ATTENZIONE fatelo solo dopo aver compreso e applicato completamente le indicazioni di Agilent Conoscere il modulo di valutazione spettri In questo volume Questo manuale descrive i concetti che stanno alla base del funzionamento del modulo di valutazione spettri della ChemStation Agi
82. tivo utilizzando la tavola di calibrazione Questa modalit di ricerca si rivolge solo ai composti per i quali stato calibrato un metodo La ChemStation paragona gli spettri dei picchi solo per i composti calibrati con spettri di fino a quattro biblioteche I picchi vengono segnalati come identificati solo se confermati da una comparazione fra spettri Siccome sono definiti nella tavola di calibrazione la ChemStation ricerca gli stessi nomi all interno della biblioteca Si pu specificare una finestra obbiettivo per i tempi di ritenzione come parte del metodo di ricerca Per l identificazione vengono usati soltanto quei picchi per i quali i tempi di ritenzione corrispondono alla finestra stabilita Si considera un composto identificato solo quando la sostanza che si avvicina di pi supera la soglia stabilita Questa modalit consigliata per la ricerca di composti specifici calibrati all interno del cromatogramma da preferire alla prima modalit di ricerca se il cromatogramma contiene molti composti ma solo alcuni quelli che interessano sono calibrati 3 Analisi del composto obbiettivo utilizzando una biblioteca di spettri In questo caso la ricerca rivolta al contenuto completo della biblioteca non solo ai composti che risultano sulla tavola di calibrazione La ChemStation utilizza la biblioteca di spettri come base Quindi paragona tutti gli spettri della biblioteca agli spettri contenuti nel cromatogramma e tenta d
83. tri a seconda della concentrazione ed il composto viene segnalato come impuro Se la concentrazione troppo bassa i rapporti segnale rumore degli spettri saranno limitati e la sensibilit dell analisi di purezza risulta molto ridotta L analisi di purezza pi accurata e sensibile quella dei picchi da 250 a 800 mAU di altezza Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Le pagine che seguono descrivono le impostazioni consigliate per controllare la purezza Se viene segnalata una possibile impurezza si possono guardare i risultati in modo un p pi critico per confermare l impurezza e caratterizzarla meglio Impostazione delle opzioni di purezza Scegliere le impostazioni che seguono dalle apposite funzioni della finestra di dialogo Options Spettro di riferimento Gli spettri di riferimento sono spettri della linea di base utilizzati per correggere l assorbanza di fondo Consigliamo di usare sempre uno spettro di riferimento L impostazione consigliata Automatic Peak Baseline In questo modo lo spettro viene preso alla linea di base all inizio ed alla fine dell integrazione L estrapolazione lineare di questi due spettri viene utilizzata per correggere tutti gli spettri del picco Dato che si tratta di un riferimento a due punti in grado di compensare spostamenti del rivelatore e modifiche della composizione della fase mobile che utilizza gradienti Le altre modalit di r
84. tto da ogni spettro del picco Questo tipo di correzione non pu essere utilizzato per un assorbimento di fondo soggetto a variazione Quando vengono scelti due spettri della linea di base viene effettuata una interpolazione lineare fra i due Uno spettro di riferimento ricostruito basandosi sull interpolazione lineare viene sottratto da ogni spettro del picco Questo tipo di correzione pu essere usata per compensare un assorbimento di fondo che si modifica lentamente Selezione automatica del riferimento Nella selezione automatica del riferimento gli spettri scelti dipendono dalla modalit di archiviazione degli spettri presenti nel file di dati All Spectra Gli spettri dell inizio e della fine del picco integrato relativi al picco scelto vengono presi come spettri di riferimento ed interpolati linearmente come avviene per la selezione manuale con due spettri di riferimento Peak controlled Spectra Lo spettro della linea di base pi vicino viene preso come spettro di riferimento e sottratto come avviene per la selezione manuale con uno spettro riferimento Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Tecniche di purezza dei picchi Le tecniche di purezza possono essere utilizzate solo con picchi separati alla linea di base Se i picchi non sono separati alla linea di base la tecnica di purezza diventa pi complicata da applicare perch ogni picco contiene i picchi vicini come se fosser
85. tutti gli altri spettri si otterranno le informazioni pi significative in questo caso Picco con il 2 di impurezza zA a I A o Rapporto fra lo Rapporto fra lo Rapporto fra lo Rapporto fra lo spettro frontale spettro spettro spettro e tutti e tutti e tutti e tutti gli altri spettri gli altri spettri gli altri spettri gli altri spettri Figura 24 Curve di rapporto per diversi spettri specificati dello stesso picco La Figura 24 illustra la curva di rapporto per gli spettri anteriore dell apice di coda e di media di un picco contenente un impurezza dopo il massimo della risposta apice Lo spettro del fronte anteriore da solo una piccola impurezza spettrale alla fine del picco La deviazione di questa prima curva di rapporto piccola perch lo spettro anteriore assorbe poco con una curva di soglia alta Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Lo spettro all apice evidenzia un livello di impurezza basso nella parte anteriore del picco lo spettro all apice contiene solo una quantit molto limitata di impurezze ed un livello molto alto in coda al picco Lo spettro di coda con un livello di impurezza molto elevato produce impurezza spettrale nella parte anteriore del picco Lo spettro medio una media di cinque spettri del picco scelti indica impurezza spettrale nel picco totale Questo spettro contiene il contributo spettrale dell impurezza In questo cas
86. urante i calcoli sulla purezza dei picchi possibile stabilire questo per 7 o 9 spettri per picco Conoscere il modulo di valutazione spettri 57 3 58 Valutazione della purezza dei picchi Soglia mAU dipende dal sistema da 0 a 5 mAU Soglia per spettri da usare in calcoli sulla purezza Spettri con una scala di assorbanza inferiore a questo valore non vengono usati in calcoli sulla purezza Soglia di purezza Non usata con le curve di soglia Impostazione raccomandata di Advanced Purity Preferences Processo del segnale Absorbance threshold for signals mAU 2 Normalize Maximum Processamento degli spettri Non utilizzato Spectra Normalization Normalize Match Purity Livello di purezza calcolato con Average Spectrum Curva di similarit visualizzata come Ln Similarity amp Threshold Curva di soglia Calcolare la deviazione standard del rumore a min 0 con 14 spettri Informazioni aggiuntive Purezza Usare Average Spectrum per una purezza non interattiva La curva di similarit viene calcolata usando lo spettro medio dal parametro Spectra per Peak con tutti gli spettri registrati sul picco Curva di soglia Calcolare il rumore con spettri all intersezione di una linea di base piatta da circa 12 a 25 spettri Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Esempio n 2 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco con curve di similarit Interpretazione manu
87. utazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Correzione del disturbo di fondo tramite selezione di uno spettro di riferimento Per correggere effetti dovuti al fondo sono disponibili diversi tipi di correzione per estrarre spettri di picco dal file di dati Correzione con uno spettro singolo Uno spettro selezionato estratto in un determinato momento definito dal file di dati viene sottratto dagli spettri del picco Questo tipo di correzione non pu essere utilizzato per un assorbimento di fondo soggetto a variazione Correzione con linea di base Uno spettro singolo della linea di base preso dal file di dati o uno spettro interpolato fra due spettri della linea di base viene sottratto dagli spettri del picco Questo tipo di correzione pu essere usata per compensare un assorbimento di fondo che si modifica lentamente Correzione con lo spettro dell apice del picco Uno spettro di riferimento preso all apice del picco viene sottratto da tutti gli altri spettri del picco Questo tipo di correzione pu essere usato se gli spettri della linea di base del picco non sono disponibili Linea di base del picco Peak Baseline Per la modalit Peak Baseline gli spettri di riferimento scelti dipendono dal tipo di archiviazione All spectra stored L inizio e fine integrazione del picco scelto vengono presi come tempi per gli spettri di riferimento di sinistra e di destra Peak controlled spectra I primi spettri de
88. utilizzare per il calcolo della purezza Per esaminare in modo pi dettagliato gli spettri del picco si possono utilizzare le funzioni grafiche della ChemStation Agilent 70 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Normalizzazione di spettri Una tecnica di purezza ordinaria richiede la normalizzazione e la comparazione di spettri presi su tutto il picco La normalizzazione compensa i cambiamenti di concentrazione del componente che passa attraverso la cella del rivelatore durante l eluizione La funzione normalmente disponibile sulla ChemStation Gli spettri vengono acquisiti ad esempio sulla curva ascendente all apice e sulla curva discendente del picco Gli spettri vengono normalizzati e sovrapposti per la presentazione grafica Questa tecnica valida per la valutazione di dati interattivi ed adattata anche alle analisi di routine In alternativa se si preferisce un fattore numerico gli spettri sulla curva ascendente e quelli sulla curva discendente possono essere comparati tramite operazione matematica ed i fattori di purezza di ogni picco stampati unitamente ai tempi di ritenzione La Figura 19 illustra un esempio nel quale gli spettri sono stati acquisiti sulla curva ascendente all apice e sulla curva discendente dei picchi e quindi normalizzati La comparazione visiva e il fattore di purezza calcolato con il software mostrano la differenza fra picco puro e picco impuro i S
89. valutazione spettri 59 3 Valutazione della purezza dei picchi Purity Non usata con le curve di soglia Impostazione raccomandata di Advanced Purity Preferences Processo del segnale Scala temporale del segnale da visualizzare peak width 4 Absorbance threshold for signals mAU 2 Normalize Maximum Processamento degli spettri Non utilizzato Spectra Normalization Normalize Match Purity Livello di purezza calcolato con Spettri di tutti i picchi Curva di similarit visualizzata come Ln Similarity amp Threshold Curva di soglia Calcolare la deviazione standard del rumore a min 0 con 14 spettri Informazioni aggiuntive Purity Si usa qualsiasi modalit per una purezza dei picchi interattiva La curva di similarit si calcola con lo spettro selezionato come funzione di tutti gli spettri del picco Curva di soglia Per lo stesso file si pu usare un valore calcolato in precedenza per ridurre il tempo di calcolo Calcolare il rumore con spettri all intersezione di una linea di base piatta da circa 12 a 25 spettri 60 Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Esempio n 3 Tutti gli spettri o tutti gli spettri del picco senza curve di similarit Questa impostazione porta a risultati rapidi ma meno accurati Impostazione raccomandata per Purity Preferences Spettro di riferimento Automatic Peak Baseline Wavelenght Range Come richiesto Purity Display Draw Spectra On
90. zza dei picchi E possibile ottimizzare il processo di purezza dei picchi per determinare l accuratezza o le prestazioni stabilendo preferenze relativamente a Numero di spettri usati in un picco Intervallo di lunghezza d onda usato per determinare la purezza Spettri di riferimento Soglia di purezza Processamento spettrale compresi i fattori logaritmici di regolarizzazione e di tracciatura curvilinea oltre all ordine della derivata Normalizzazione degli spettri Componenti della purezza calcolati e visualizzati Questi comprendono gli spettri le differenze spettrali i segnali ed un raziogramma che li utilizza curve di soglia e similarit Esistono molte tecniche da usare per giudicare la purezza dei picchi Alcune sono descritte nelle sezioni che seguono e comprendono normalizzazione degli spettri comparazione di spettri normalizzati provenienti da diverse sezioni del picco raziogramma rapporto di assorbanza a due lunghezze d onda rapprensentate nell intervallo di tempo curva di similarit comparazione di uno spettro selezionato medio a tutti gli altri spettri presi durante l eluizione del picco Conoscere il modulo di valutazione spettri Valutazione della purezza dei picchi 3 Purezza dei picchi Tecnica 1 Normalizzazione di spettri Si tratta di una tecnica molto comune che comprende la normalizzazione e la comparazione di spettri presi dal picco La normalizzazione compensa i cambiamenti di concentraz

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